Возможности и проблемы доставки вакцин на основе мРНК
Школа Души Божественного Космоса :: В поисках правды: инсайдеры и теории заговоров :: Разоблачители коронамракобесия
Страница 1 из 1
Возможности и проблемы доставки вакцин на основе мРНК
Возможности и проблемы доставки вакцин на основе мРНК
- 1:
[url=https://z5h64q92x9.net/proxy_u/en-ru.ru.9133ffb7-628c7362-15c5bc93-74722d776562/https/pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Wadhwa A[Author]]Абишек Вадхва[/url], [url=https://z5h64q92x9.net/proxy_u/en-ru.ru.9133ffb7-628c7362-15c5bc93-74722d776562/https/pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Aljabbari A[Author]]Anas Aljabbari[/url], [url=https://z5h64q92x9.net/proxy_u/en-ru.ru.9133ffb7-628c7362-15c5bc93-74722d776562/https/pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Lokras A[Author]]Abhijeet Lokras[/url], [url=https://z5h64q92x9.net/proxy_u/en-ru.ru.9133ffb7-628c7362-15c5bc93-74722d776562/https/pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Foged C[Author]]Камилла запотела[/url], и [url=https://z5h64q92x9.net/proxy_u/en-ru.ru.9133ffb7-628c7362-15c5bc93-74722d776562/https/pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=Thakur A[Author]]Аниш Тхакур[/url]*Аннотация
В последние несколько лет все большее внимание уделяется использованию мессенджерной РНК (мРНК) в качестве нового терапевтического метода. Текущие клинические усилия, охватывающие препараты на основе мРНК, направлены на вакцины против инфекционных заболеваний, иммунотерапию рака, заместительную терапию терапевтическими белками и лечение генетических заболеваний. Однако проблемы, которые препятствуют успешному переводу этих молекул в лекарственные средства, заключаются в том, что (i) мРНК является очень большой молекулой, (ii) она внутренне нестабильна и подвержена деградации нуклеазами, и (iii) она активирует иммунную систему. Хотя некоторые из этих проблем были частично решены с помощью химической модификации мРНК, внутриклеточная доставка мРНК по-прежнему представляет собой серьезное препятствие. Клинический перевод терапии на основе мРНК требует технологий доставки, которые могут обеспечить стабилизацию мРНК в физиологических условиях. Здесь мы (i) рассмотрим возможности и проблемы в доставке терапевтических средств на основе мРНК с акцентом на невирусные системы доставки, (ii) представим клинический статус вакцин на основе мРНК и (iii) осветим перспективы будущего этого многообещающего нового типа медицины.
Ключевые слова: мРНК, вакцины, терапевтические, профилактические, системы доставки лекарств, липиды, полимеры, наночастицы, наномедицина1. Введение
Вакцинация оказала огромное влияние на глобальное здравоохранение и качество жизни человека, снизив смертность и заболеваемость, вызванные инфекционными заболеваниями. Разработка вакцин основана на классической парадигме 3I “изоляции, инактивации и инъекции” возбудителя микроорганизма, введенной Луи Пастером [1]. Вакцины могут быть профилактическими или терапевтическими и могут быть широко классифицированы как живые аттенуированные вакцины (ослабленные микроорганизмы), инактивированные вакцины (убитые микроорганизмы), субъединичные вакцины (очищенные антигены) или анатоксиновые вакцины (инактивированные бактериальные токсины). В отличие от традиционной концепции инъекции живых аттенуированных или инактивированных патогенов, современные вакцинные подходы, т.Е. субъединичные вакцины, сосредоточены на проявлении эффективности, аналогичной обычным вакцинам, при одновременном устранении рисков безопасности, связанных с цельноклеточными вакцинами. Тем не менее, антигены субъединиц часто проявляют более низкую иммуногенность, что может быть исправлено путем использования систем доставки и / или иммунопотенцирующих соединений в качестве адъювантов для повышения иммуногенности. Современный геномный рациональный дизайн вакцины предлагает огромный потенциал по сравнению с традиционными подходами к вакцинам на основе всего организма.
Вакцины на основе нуклеиновых кислот, т.Е. ДНК (в виде плазмид) и РНК (в виде мессенджерной РНК (мРНК)), открывают путь для безопасных и эффективных биологических препаратов для имитации инокуляции вакцинами на основе живых организмов, особенно для стимуляции клеточно-опосредованного иммунитета [2]. Эта технология демонстрирует многообещающий потенциал для разработки новых вакцин против широкого спектра показаний и заболеваний, от профилактики до терапии инфекционных заболеваний, рака, аутоиммунных заболеваний и гиперчувствительности. Хотя вакцины на основе нуклеиновых кислот демонстрируют значительные преимущества перед традиционными вакцинами [3] с точки зрения безопасности, эффективности, индукции как В-, так и Т-клеточных реакций и специфичности, следует отметить, что мРНК-вакцины имеют преимущества по сравнению с вакцинами на основе других типов нуклеиновых кислот. Техническая задача, связанная с ДНК-вакцинами, заключается в обеспечении доставки в ядро клетки, где транскрипция антигена происходит до ядерного экспорта и трансляции в белок в цитоплазме. Кроме того, ДНК-вакцины несут потенциальный риск интеграции в геном хозяина, что может привести к инсерционному мутагенезу. Напротив, мРНК-вакцины нацелены только на цитоплазматическую доставку, обходя риск геномной интеграции [4]. Относительно короткий период полувыведения приводит к транзиторной и более контролируемой экспрессии кодируемого антигена. Кроме того, мРНК может быть получена в бесклеточной среде путем транскрипции in vitro (IVT), тем самым избегая использования микробов или культивируемых клеток для производства и избегая связанных с этим проблем качества и безопасности в производстве. Это обеспечивает простую последующую очистку и быстрое и экономичное производство [5]. Однако мРНК часто публикуется на основании распространенного мнения, что при использовании мРНК, в отличие от ДНК, строгие правила генной терапии обходятся, поскольку мРНК не интегрируется в геном хозяина. Однако на самом деле это справедливо только для США, поскольку в Европе любой активный фармацевтический ингредиент, содержащий или состоящий из рекомбинантной нуклеиновой кислоты, используемый в организме человека или вводимый ему, подпадает под действие регламента по лекарственным средствам для продвинутой терапии [6]. Поэтому терапия на основе мРНК классифицируется как генная терапия. Растущая область вакцин на основе мРНК очень интересна [3,7], и за последнее десятилетие было получено значительное количество соответствующих доклинических данных, и было начато несколько клинических испытаний. Это дает начало видению перевода вакцин на основе мРНК в применение человека для профилактики и терапии. В этом обзоре мы обсуждаем современные тенденции в подходах к мРНК-вакцинам и различные стратегии и системы доставки мРНК-вакцин.2. мРНК как вакцины
Центральная догма молекулярной биологии гласит, что ДНК транскрибируется в мРНК, которая впоследствии транслируется в белок [8]. Поток генетической информации во времени и пространстве управляется сложными регуляторными механизмами. Генная терапия представляет собой введение генетического материала в клетки и биологические ткани человека. Такие методы, как вставка, изменение или удаление генов, используются для коррекции дефектных генов, ответственных за развитие заболевания, которое затем излечивает заболевание или улучшает клинический статус пациента [9]. Несколько векторов были использованы для генной терапии, и они обычно классифицируются как невирусные и вирусные векторы. Невирусные векторы обладают рядом преимуществ по сравнению с вирусными векторами, включая низкую иммуногенность хозяина и потенциал для масштабирования [10]. Однако успех невирусной генной терапии в прошлом был очень ограничен, главным образом из-за барьеров, существующих для доставки плазмидной ДНК (p-ДНК), например, необходимости пересечения ядерной мембраны перед трансляцией, наличия генов устойчивости к антибиотикам в p-ДНКи, самое главное, трудностей вконтроль и регулирование долгосрочной экспрессии. Отсутствие контроля долгосрочной экспрессии p-ДНК представляет собой огромный недостаток с точки зрения продолжительности лечения и возможных побочных эффектов, что в отличие от обычных лекарств, где лечение может быть прекращено мгновенно. Эти недостатки p-ДНК, возможно, могут быть преодолены с помощью мРНК [11]. мРНК переносит генетическую информацию из ДНК в ядре в цитозоль, где она используется рибосомами в качестве шаблона для синтеза белка. В отличие от p-ДНК, мРНК эффективна как в митотических, так и в немитотических клетках, поскольку мРНК выполняет свою функцию в цитоплазме, следовательно, ее функция не зависит от активного деления клеток. Кроме того, в отличие от p-ДНКили вирусных векторов, мРНК не содержит дополнительных чужеродных генов, что делает мРНК более безопасным вектором. Проблема долгосрочной экспрессии, создаваемая p-ДНК, также может быть преодолена с помощью мРНК, поскольку мРНК опосредует быструю, временную экспрессию кодируемого белка, а продолжительность продукции четко определена (обычно несколько дней или недель, в зависимости от конкретной платформы мРНК). Это делает экспрессию мРНК легче контролировать, чем экспрессию генов из p-ДНК и вирусных векторов [11]. Кроме того, производство мРНК является бесклеточным, что сильно снижает вероятность загрязнения мРНК бактериальными компонентами. Это облегчает производство мРНК, чем p-ДНК, в условиях надлежащей производственной практики [12]. Наконец, вектор-индуцированной иммуногенности можно избежать для мРНК-терапии, в отличие от вирусных векторов или вирусоподобных частиц, которые могут вызывать специфический иммунный ответ против экспонированных вирусных белков [13]. Конкретные терапевтические применения мРНК, которые в настоящее время изучаются, включают (i) вакцинацию против рака и инфекционных заболеваний, (ii) заместительную белковую терапию и (iii) редактирование генов. В таблице 1 приведены примеры текущих клинических испытаний кандидатов на терапевтическую и профилактическую вакцину на основе мРНК.
Последний раз редактировалось: dimslav (Вт Май 24, 2022 12:39 pm), всего редактировалось 1 раз(а) (Обоснование : Текст отредактирован полностью Дмитрием)
dimslav- Сообщения : 12381
Дата регистрации : 2017-04-29
Возраст : 55
Re: Возможности и проблемы доставки вакцин на основе мРНК
- 2:
Таблица 1
Примеры текущих клинических испытаний вакцин на основе мРНК.[th]мРНК[/th][th]Механизм действия[/th][th]Заболевание / состояние[/th][th]Способ введения[/th][th]Фаза исследования[/th][th]Спонсор/соавтор[/th][th]Национальный идентификатор клинических исследований[/th] Терапевтическая
мРНКВакцина W_ova1 Индукция противоопухолевого иммунного ответа Рак яичников Внутривенное введение Фаза I Университетский медицинский центр Гронингена/BioNTech NCT04163094 CT7, MAGE-A3 и WT1 мРНК-электропорированные клетки Лангерганса (LCs) Электропорация дендритных клеток мРНК антигена Множественная миелома Подкожные Фаза I Мемориальный онкологический центр Слоана Кеттеринга NCT01995708 Персонализированная клеточная мРНК Иммунизация с помощью DCS, импульсно кодируемых мРНК-опухолевыми антигенами Рак головного мозга / метастазы новообразований Не уточняется Фаза I Guangdong 999 Brain Hospital/Beijing, Tricision, Trinomab, Jinan University Guangzhou NCT02808416 Персонализированная мРНК Иммунизация с помощью DCS-импульсов с персонализированной мРНК Глиобластома Не уточняется Фаза I Guangdong 999 Brain Hospital/Beijing Tricision, Trinomab, Jinan University Guangzhou NCT02808364 мРНК MiHA Иммунизация DCS, загруженными мРНК MiHA Гематологические злокачественные новообразования Внутривенное введение Фаза I
Фаза IIУниверситет Радбуда / ZonMw: Нидерландская организация исследований и разработок в области здравоохранения
Голландское онкологическое обществоNCT02528682 WT1-mRNA Иммунизация DCs, электропорированными WT1-мРНК Острый миелоидный лейкоз Не уточняется Фаза II Zwi Berneman/Kom Op Tegen Kanker
stichting tegen kanker
Research Foundation - Flanders (FWO: Fonds Wetenschappelijk Onderzoek)NCT01686334 мРНК ЦМВ pp65-LAMP человека Иммунизация DCs импульсной мРНК CMV pp65-LAMP Глиобластома Внутрикожные Фаза II Гэри Арчер доктор философии / Университет Дьюка NCT03927222 Персонализированная мРНК Персонализированная мРНК-опухолевая вакцина, кодирующая неоантиген Прогрессирующая плоскоклеточная карцинома пищевода, аденокарцинома желудка, аденокарцинома поджелудочной железы, колоректальная аденокарцинома Подкожные Регистрация Больница Чанхай/ Stemirna Therapeutics NCT03468244 мРНК [BI 1361849 (ранее CV9202)] Не уточняется Метастатический немелкоклеточный рак легких Не уточняется Фаза I Фаза II Институт исследований рака Людвига/Cancer Research Institute, New York City, Boehringer Ingelheim
MedImmune, CureVac, PharmaJetNCT03164772 mRNA-5671/V941 Не уточняется Новообразования, карцинома, немелкоклеточное легкое, новообразования поджелудочной железы, колоректальные новообразования Внутримышечно Фаза I Merck Sharp & Dohme NCT03948763 mRNA-4157 Иммуностимуляторы Солидные опухоли Не уточняется Фаза I Moderna/Merck Sharp & Dohme NCT03313778 mRNA-4157 Иммунотерапия персонализированной противораковой вакциной Меланома кожи Не уточняется Фаза II Moderna/Merck Sharp & Dohme NCT03897881 Персонализированная мРНК Кодирование неоантигена Рак пищевода
Немелкоклеточный рак легкихПодкожные Регистрация Stemirna Therapeutics / Первая дочерняя больница Университета Чжэнчжоу NCT03908671 mRNA-3704 Стимуляторы альфа-галактозидазы; Стимуляторы метилмалонил КоА-мутазы; Стимуляторы синтеза белка Метилмалоновая ацидемия, метаболизм, врожденные ошибки Внутривенное введение Фаза I
Фаза IIModerna NCT03810690 mRNA-2416 Модуляторы лигандов OX40 Рецидивирующие / рефрактерные солидные злокачественные опухоли или лимфомы Интратуморальная Фаза I Moderna NCT03323398 mRNA-2752 Стимуляторы белка IL36G; стимуляторы интерлейкина 23; модуляторы лиганда OX40 Рецидивирующие / рефрактерные солидные злокачественные опухоли или лимфомы Интратуморальная Фаза I Moderna/AstraZeneca NCT03739931 Профилактическая мРНК мРНК-1647, мРНК-1443 Не уточняется Цитомегаловирус Не уточняется Фаза I Moderna NCT03382405 мРНК-1893 Не уточняется Вирус Зика Не уточняется Фаза I Moderna/Biomedical Advanced Research and Development Authority NCT04064905 мРНК-1653 Комбинированная вакцина против метапневмовируса человека и вируса парагриппа человека типа 3 Метапневмовирус человека и парагриппозавирус человека Не уточняется Фаза I Moderna. NCT03392389
NCT04144348мРНК-1944 Кодирование моноклонального антитела к вирусу чикунгуньи Вирус чикунгуньи Парентеральный Фаза I Moderna NCT03829384 мРНК-1653 Иммуностимуляторы Метапневмовирус и вирус парагриппа Парентеральный Фаза I Moderna NCT03392389 CV7202 Иммуностимуляторы Бешенство Внутримышечно Фаза I CureVac NCT03713086
В качестве вакцинных векторов обычно используются два класса мРНК: нереплицирующаяся и самоамплифицирующаяся. Нереплицирующаяся мРНК кодирует только белковый антиген (ы), представляющий интерес, в то время как самоамплифицирующаяся мРНК также кодирует белки, обеспечивающие репликацию РНК [14]. Вакцины на основе самоамплифицирующейся мРНК кодируют РНК-геном одноцепочечного РНК-вируса, например альфавируса, флавивируса [15] или пикорнавируса [7]. Они разработаны для увеличения продолжительности и уровня экспрессии, а также последующего иммунного ответа, индуцированного кодируемым антигеном (антигенами). Они эффективно усиливают продукцию субгеномной мРНК, кодирующей интересующий антиген (ы), после одного раунда репликации. В то время как как самоусиливающаяся мРНК, так и нереплицирующаяся мРНК находят применение в профилактических вакцинах для инфекционных заболеваний, нереплицирующаяся мРНК используется для вакцин против рака.3. Фундаментальная фармакология мРНК-вакцин
Транскрибированная In vitro (IVT) мРНК используется терапевтически, поскольку она имитирует полностью зрелую нативную мРНК, присутствующую в цитозоле эукариот [16]. Это может быть достигнуто либо путем трансфекции ex vivo клеток с мРНК, которые затем адоптивно переносятся, либо путем прямой доставки in vivo мРНК IVT в цитозоль [17]. Эти подходы изучаются для геномной инженерии, генетического перепрограммирования, иммунотерапии рака и инфекционных заболеваний на основе адоптивных Т-клеток и дендритных клеток (DC), схем толерантности для лечения аллергии и заместительной белковой терапии. Как трансфекция ex vivo, так и прямая трансфекция in vivo позволяют клеткам-мишеням синтезировать кодируемые белки in situ, где мРНК используется в качестве матрицы, а белки представляют собой активный продукт. Открытая рамка считывания (ORF) зрелой мРНК, кодирующей интересующий белок (активный продукт), маркированный стартовым и стоп-кодонами соответственно, окружена нетранслируемыми областями (UTR) и в идеале состоит из 5’-колпачка и поли (А) хвоста [3].
Фармакодинамическая активность как нативной, так и IVT-мРНК происходит в цитозоле (рис. 1). Однако, в отличие от эндогенной мРНК, которая транскрибируется из ДНК в ядре и поступает в цитозоль через ядерный экспорт, мРНК IVT поступает в цитозоль из внеклеточного источника [18]. Как только мРНК IVT доставляется в цитозоль, ее фармакология регулируется теми же сложными клеточными механизмами, которые регулируют стабильность и трансляцию эндогенной мРНК. Сконструированная мРНК IVT настолько похожа на эндогенную мРНК, что механизм клеточной трансляции легко используется для синтеза белка, который может подвергаться посттрансляционным модификациям, в конечном итоге приводящим к зрелому белковому продукту (продуктам). В случае вакцин этот зрелый белковый продукт (ы) представляет собой антиген (ы), который может вызывать мощные патоген-специфические гуморальные и клеточно-опосредованные иммунные ответы. Однако конечное внутриклеточное назначение определяется естественной или инженерной последовательностью (последовательностями) сигнального пептида или трансмембранного домена [7]. Поэтому мРНК-вакцины могут быть разработаны для доставки кодируемого белка (ов) в желаемый клеточный компартмент для правильной презентации и / или функции [19].
[url=https://z5h64q92x9.net/proxy_u/en-ru.ru.9133ffb7-628c7362-15c5bc93-74722d776562/https/www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click on image to][/url]
[url=https://z5h64q92x9.net/proxy_u/en-ru.ru.9133ffb7-628c7362-15c5bc93-74722d776562/https/www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click on image to][/url]
Рисунок 1
Механизм действия мРНК-вакцин. 1. мРНК транскрибируется in vitro (IVT) из матрицы ДНК в бесклеточной системе. 2. мРНК IVT впоследствии трансфицируется в дендритные клетки (DCs) посредством (3) эндоцитоза. 4. Захваченная мРНК подвергается эндосомальному побегу и высвобождается в цитозоль. 5. Используя трансляционный механизм клеток-хозяев (рибосомы), мРНК транслируется в антигенные белки. Транслируемый антигенный белок подвергается посттрансляционной модификации и может действовать в клетке, где он генерируется. 6. Альтернативно, белок секретируется из клетки-хозяина. 7. Белок антигена разлагается протеасомой в цитоплазме. Генерируемые антигенные пептидные эпитопы транспортируются в эндоплазматический ретикулум и загружаются на основные молекулы комплекса гистосовместимости (MHC) класса I (MHC I). 8. Загруженные комплексы эпитопов MHC I-пептида представлены на поверхности клеток, что в конечном итоге приводит к индукции антиген-специфических ответов CD8 + Т-клетокпосле распознавания Т-клеточного рецептора и соответствующей совместной стимуляции. 9. Экзогенные белки поглощаются DCs. 10. Они деградируют в эндосомах и представлены через путь MHC II. Кроме того, для получения родственной Т-клеточной помощи в антигенпрезентирующих клетках белок должен быть направлен через путь MHC II. 11. Генерируемые антигенные пептидные эпитопы впоследствии загружаются на молекулы МНС II. 12. Нагруженные комплексы эпитопов MHC II-пептида представлены на поверхности клеток, что приводит к индукции антигенспецифических ответов CD4 + Т-клеток. Экзогенные антигены также могут быть обработаны и загружены на молекулы МНС класса I с помощью механизма, известного как перекрестная презентация (не показана на рисунке). Рисунок был создан с BioRender.com .
Фармакокинетика мРНК IVT определяется периодом полураспада мРНК и полученного зрелого белка после посттрансляционной модификации. Двумя основными факторами, влияющими на биодоступность экзогенной мРНК в цитозоле, являются (i) быстрая опосредованная РНКазой деградация и (ii) отсутствие пассивной диффузии через плазматическую мембрану из-за высокой молекулярной массы и электростатического отталкивания между отрицательными зарядами клеточной мембраны, покрытой протеогликаном, и отрицательно заряженными молекулами мРНК[20]. Голая мРНК быстро разлагается внеклеточными РНКазами, что препятствует ее эффективной доставке и эффективности. Было показано, что широкий спектр реагентов для трансфекции in vitro и in vivo защищает мРНК от деградации и облегчает клеточное поглощение и эндосомальный побег мРНК. Основные усилия были направлены на улучшение ферментативной стабильности РНК, как обсуждается далее ниже [3]. В конечном счете, мРНК IVT, состоящая из природных нуклеотидов, метаболизируется присущими физиологическими механизмами, что снижает риск токсичности, вызванной метаболитами. Поэтому проблемы доставки могут быть преодолены подходами, включающими инкапсуляцию мРНК в системы доставки лекарств, состоящие из катионных молекул, липидов, полимеров и наночастиц [21], а также нацеливание на DC [22]. Кроме того, было показано, что физические методы трансфекции, такие как электропорация, повышают эффективность доставки больших самоамплифицирующихся мРНК in vivo при измерении экспрессии репортерных генов и иммуногенности генов, кодирующих белки оболочки ВИЧ [23].
Последний раз редактировалось: dimslav (Вт Май 24, 2022 12:40 pm), всего редактировалось 1 раз(а) (Обоснование : редакция)
dimslav- Сообщения : 12381
Дата регистрации : 2017-04-29
Возраст : 55
Re: Возможности и проблемы доставки вакцин на основе мРНК
- 3:
4. Подходы к повышению стабильности мРНК
Разработка препаратов на основе мРНК началась в 1990 году с успешной экспрессии ряда различных белков при введении мРНК, кодирующей эти белки, непосредственно в мышцы мышей [24]. Это привело к (i) тестированию первой вакцины на основе мРНК в 1993 году, которая, как было показано, индуцирует противогриппозный цитотоксический ответ Т-лимфоцитов у мышей [25], и (ii) первой вакцинации мРНК-кодирующими раковыми антигенами в 1995 году [26]. Эти зарождающиеся демонстрации подтвердили потенциал мРНК для (i) экспрессии специфических белков in situ и (ii) для индукции защитного антиген-специфического клеточного и гуморального иммунитета. Однако этой областью пренебрегали в течение почти десяти лет, пока не был обнаружен потенциал применения мРНК in vivo, т.е. индукции специфических цитотоксических Т-лимфоцитов и антител [27]. Достижения в области мРНК были медленными из-за лабильной природы мРНК, что делает эксперименты с использованием немодифицированной мРНК очень сложными, если не соблюдать меры предосторожности при обращении с мРНК [28]. Вместо этого основное внимание было направлено на препараты на основе ДНК, поскольку ДНК более стабильна, чем РНК.
В бесклеточной системе мРНК может быть синтезирована путем IVT ДНК-матрицы (например, линеаризованной плазмиды или продукта ПЦР), которая кодирует все структурные элементы функциональной мРНК. Для выполнения реакции IVT требуются все элементы естественного процесса транскрипции, т.Е. ДНК-матрица, РНК-полимераза и нуклеотидные строительные блоки. Во время последующей очистки мРНК матрица ДНК часто разрушается добавлением ДНКаз с последующей очисткой с помощью других традиционных методов выделения мРНК, например, осаждения и хроматографии. Этот процесс приводит к получению высокочистых мРНК-продуктов, готовых к использованию [29,30,31]. Было проведено несколько стратегий для преодоления присущего мРНК отсутствия стабильности и потенциальной иммуногенности, которые обсуждаются далее ниже.4.1. Молекулярная стабилизация
Стратегии, включая разработку последовательностей и / или структуры для повышения стабильности мРНК (продления периода полураспада) и трансляции, часто играют важную роль в повышении уровней экспрессии белка. Методы, используемые для достижения этой цели, включают удлинение поли (А) хвоста, модификацию 5’-колпачка, разработку UTRS и паттернов последовательностей в ORF и / или включение модифицированных нуклеотидов (рис. 2).
[url=https://z5h64q92x9.net/proxy_u/en-ru.ru.9133ffb7-628c7362-15c5bc93-74722d776562/https/www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click on image to][/url]
[url=https://z5h64q92x9.net/proxy_u/en-ru.ru.9133ffb7-628c7362-15c5bc93-74722d776562/https/www.ncbi.nlm.nih.gov/core/lw/2.0/html/tileshop_pmc/tileshop_pmc_inline.html?title=Click on image to][/url]
Рисунок 2
Структура in vitro транскрибируемой (IVT) мРНК и широко используемые стратегии модификации. Конструкция мРНК IVT основана на схеме эукариотической мРНК и состоит из 5’cap, 5’ и 3’ нетранслируемых областей (UTRS), открытой рамки считывания (ORF), кодирующей антиген (ы), и 3’поли (А) хвоста. мРНК IVT может быть модифицирована в одном или нескольких сайтах, например, путем модификации caps, UTRs и / или поли (А) хвоста, чтобы модулировать продолжительность и кинетический профиль экспрессии белка. eIF4E, фактор инициации эукариотической трансляции 4E.4.1.1. Аналог Cap
Синтетический аналог колпачка может быть легко добавлен к мРНК, поскольку 5’-концевой колпачок не кодируется матрицей ДНК. Естественная эукариотическая мРНК имеет 7-метилгуанозиновый (m7G) колпачок, связанный с мРНК в процессе транскрипции через 5’-5’-трифосфатный мостик (ppp) [32]. Структура m7GpppN на 5’-конце шапки мРНК выполняет несколько функций [33]. Во-первых, он защищает мРНК от быстрой деградации экзонуклеазами. Во-вторых, он играет незаменимую роль во время трансляции, поскольку фактор инициации эукариот (eIF) 4E распознает и связывается с крышкой мРНК. Он также играет роль в предотвращении распознавания мРНК врожденными иммунными датчиками [34]. мРНК может содержать один из трех различных caps, т.Е. cap-0 [m7G (5’)pppN1pN2p], cap-1 [m7G (5’)pppN1mpNp] и cap-2 [m7G (5’) pppN1mpN2mp] соответственно [11]. Укупорка мРНК IVT может быть выполнена с использованием двух различных подходов: Первый подход включает добавление на втором этапе рекомбинантных каппинговых ферментов, полученных из вируса осповакцины, после транскрипции, в результате чего cap идентичен наиболее частой структуре эндогенного эукариотического cap, т.е. 7-метилгуанозиновому (m7g) cap [30]. Альтернативно, синтетический аналог cap может быть добавлен во время реакции транскрипции in vitro, следовательно, capping и транскрипция in vitro выполняются за один этап. Этот подход называется ко-транскрипционным каппингом [35]. Основным недостатком этого подхода является конкуренция между аналогом cap и нуклеотидом GTP, необходимым для транскрипции in vitro, что в конечном итоге приводит к образованию фракции некапированной и трансляционно неактивной мРНК [36]. Фракция непокрытой мРНК, содержащая 5’ppp-группы, является более иммуностимулирующей, что может быть исправлено обработкой фосфатазой для удаления ppp-группы на 5’-конце непокрытой мРНК [37].
Используются три различных класса cap-аналогов m7GpppG [38]: (i) аналоги anti-reverse cap (ARCAs) [39], (ii) 3’-O-Me-m7GpppG [40] и (iii) модифицированные ARCAs [41]. Первоначальные исследования мРНК проводились с использованием мРНК, содержащей аналог m7 cap (GpppG) [42], и в настоящее время это наиболее часто используемый мРНК cap в клинических испытаниях. К сожалению, фракция аналога m7GpppG cap, используемого во время транскрипции in vitro, включается в противоположную ориентацию и поэтому не распознается рибосомами, что в конечном итоге приводит к снижению трансляционной активности. Чтобы избежать этого, была введена так называемая ARCA с одной 3’-OH группой вместо двух 3’-OH групп (ARCAs; m2 7,3’-O GpppG) для предотвращения инкорпорации в противоположную ориентацию [43]. Было показано, что ARCAs, сопоставляющиеся с традиционными аналогами cap, демонстрируют более чем четырехкратную эффективность транскрипции РНК [44]. Кроме того, было обнаружено, что продолжительность и уровни экспрессии белка увеличиваются в клетках, трансфицированных ARCA-capped IVT РНК [41]. В последнее время появились новые типы химически модифицированных аналогов cap, например фосфоротиоат, фосфоротиолат [35], имидифосфат [45], запертая нуклеиновая кислота [46], боранофосфатные связи [47] и другие типы модификаций, которые обеспечивают мРНК устойчивость к декапированию мРНК-декапирующим ферментом 2, что в конечном итоге приводит к более длительному периоду полураспада мРНК [48].
Традиционно синтетическую 5’-Cap 0-capped РНК транскрибируют путем выполнения транскрипции in vitro, где более 80% GTP, добавленного в реакцию, замещают аналогом динуклеотидного cap (т.Е. m7G [5’]ppp [5’]G), что приводит к инициациитранскрипция аналогом cap [49]. Однако было показано, что этот подход имеет ряд недостатков, связанных с эффективностью, которые были преодолены путем внедрения ScriptCap . ScriptCap включает добавление ферментативно построенных структур cap-0 на транскрипты РНК с использованием каппингового фермента со 100% эффективностью реакции [50]. Нативная эукариотическая мРНК может содержать cap-1 или cap-2, но никогда cap-0 [11]. Поэтому мРНК IVT должна содержать cap-1 или cap-2, чтобы быть менее иммуностимулирующей [51]. Отличительной чертой этих структур cap является статус метилирования 2’ положения 5’ предпоследнего и третьего последнего нуклеозида. До появления новой технологии CleanCap , представленной компанией TriLink, синтетическая мРНК с cap-1 могла быть получена только ферментативным каппингом [52,53]. Однако cap-1 или cap-2 теперь могут быть включены во время ко-транскрипционного каппинга с эффективностью каппинга приблизительно 94% [52]. Примечательно, что эффективность каппинга была значительно выше, чем эффективность, достигаемая традиционным ко-транскрипционным каппингом с cap-0 или ARCA [54].4.1.2. 5’ и 3' нетранслируемые регионы (UTRs)
Важность включения 5’- и 3’-UTR была отмечена во время посттранскрипционной регуляции экспрессии генов in vitro [55]. Многочисленные роли, которые играют UTR, включают (i) регуляцию экспорта мРНК из ядра, (ii) регуляцию эффективности трансляции [56], (iii) оркестровку субклеточной локализации [57] и (iv) стабильность мРНК [58]. Введение 3’-концевых UTR α-глобина приводит к стабилизации мРНК, в то время как включение 5’-концевых и 3’-концевых UTR бета-глобина приводит к повышению эффективности трансляции [59]. Оптимальный результат достигается при использовании двух β-глобиновых 3’-UTR, выровненных в конфигурации "голова-хвост". α-глобиновые и β-глобиновые UTR были включены для настройки РНК для оптимизированной транскрипции in vitro с последующей электропорацией мРНК аутологичных Т-клеток [60] и интранодальной инъекцией голой антиген-кодирующей РНК [61]. Кроме того, DC, трансфицированные антиген-кодирующей UTR-оптимизированной мРНК, были использованы в исследовании, включающем иммунизацию цитомегаловирус-серопозитивных лиц и больных раком [62]. В некоторых ситуациях дестабилизация мРНК может быть жизнеспособным подходом к сокращению продолжительности синтеза белка. Это может быть достигнуто путем введения богатых аденилат-уридилатом элементов в 3’-UTR мРНК, что в конечном итоге приводит к более быстрой деградации мРНК и сокращению продолжительности экспрессии белка [63].4.1.3. Поли(А) хвост
Поли (А) хвост играет важную роль в трансляции мРНК, а также в ферментативной стабильности мРНК. Поли (А) хвост связывается с несколькими полиаденозилсвязывающими белками (PABPs), работая синергически с последовательностями 5'm7Gcap для регулирования эффективности трансляции [64]. Эукариотический фактор инициации трансляции eIF4E связывается с 5'm7G cap, который, в свою очередь, комплексуется с eIF4G и eIF4A. Затем PABP взаимодействует с N-концом эукариотического фактора инициации трансляции eIF4G, который образует mRNP (мессенджерный рибонуклеопротеин) или полисомный комплекс [65]. Первый изображает комплекс мРНК-белок, еще не участвующий в синтезе белка, в то время как второй представляет собой тот, который уже транслируется. Для циркуляции мРНК посредством связывания ПАБП с поли (А) хвостом и колпачком требуется достаточно длинный поли (А) хвост [55,66]. Было замечено, что увеличение длины хвоста поли (А) повышает эффективность генерации полисом и, следовательно, влияет на уровни экспрессии белка [67].
Показано, что постепенное увеличение длины поли (А) хвоста мРНК IVT до 120 оснований соразмерно увеличивает уровень экспрессии белка, в то время как увеличение числа оснований выше 120 не приводит к дальнейшему усилению экспрессии белка [68]. Поли (А) хвосты могут быть добавлены к мРНК путем кодирования поли (А) хвоста в матрице ДНК или путем расширения IVT РНК после транскрипции с использованием рекомбинантной поли (А) полимеразы. Однако полиаденилирование рекомбинантной поли (А) полимеразой приводит к переменной длине хвоста поли (А), что приводит к получению полиаденилированной мРНК различной длины. Поэтому предпочтительным подходом является генерация поли (А) хвостов с четко определенной длиной из мРНК, транскрибируемых из поли (А) хвостов, кодирующих ДНК-матрицы [69]. Физические взаимодействия между 5’ и 3’ концами мРНК происходят между колпачком и поли(А) хвостом [70]. Поли (А) хвост также играет роль в предотвращении декапирования и деградации мРНК, поскольку удаление или укорочение поли (А) хвоста до менее чем 12 остатков приводит к деградации мРНК путем расщепления 5’-шапочной структуры и экзонуклеолитического расщепления от 5’ до 3’ или от 3’до 5’.деградация [71].4.2. Стратегии формулирования
Несмотря на многообещающий потенциал вакцин на основе мРНК, эффективная внутриклеточная доставка мРНК в цитозоль по-прежнему представляет собой серьезное препятствие, особенно для мРНК, вводимых системно. Большая молекулярная масса (10 5-10 6 Да) [21] и высокая плотность отрицательного заряда мРНК ухудшают проникновение мРНК через клеточные мембраны. Хорошо известно, что поглощение мРНК в отсутствие системы доставки чрезвычайно низкое, а период полураспада мРНК составляет приблизительно 7 ч [72]. Кроме того, мРНК по своей природе является нестабильной молекулой, которая сильно подвержена деградации 5’-экзонуклеазами, 3’-экзонуклеазами и эндонуклеазами [73]. Следовательно, системы доставки необходимы для внутриклеточной доставки мРНК к терапевтическому месту действия in vitro, а также in vivo [8,74]. Различные стратегии были исследованы для улучшения доставки РНК, включая улучшенные стратегии инъекций, такие как микроинъекции [75], РНК-патчи [76], введение на основе генной пушки [77], конденсация протамина [78], РНК-адъюванты [79] и инкапсуляция РНК в наночастицы, состоящие из липидов и / илиполимеры [80]. Как правило, мРНК IVT для цитозольной доставки формулируется с помощью системы доставки путем смешивания с комплексообразующим агентом [81], который может защитить мРНК от быстрой деградации и облегчить клеточное поглощение. Хотя общая догма в этой области заключается в том, что эффективные носители необходимы для существенного усиления трансфекции мРНК in vivo, голые мРНК применялись во многих исследованиях in vivo. Следовательно, в следующем разделе обсуждается доставка голой мРНК, а затем разделы, обсуждающие доставку мРНК на основе вектора [82,83,84,85].4.2.1. Голая РНК
Простейшая стратегия введения включает внутримышечную (i.m.) инъекцию голой мРНК, и доказательство концепции было первоначально продемонстрировано экспрессией репортерного гена in vivo у мышей [24]. С тех пор эффективность голой мРНК была подтверждена при внутримышечных [86], подкожных (s.c.) [87] или внутрикожных (i.d.) [88] инъекциях.различных кожных заболеваний и улучшения заживления ран путем экспрессии in situ специфических белков в коже [75,89]. Принятие этого подхода позволяет обойти несколько препятствий, связанных с системным введением мРНК, например, клиренс из кровотока через печень, почки и селезенку [75]. Очень эффективная трансляция кодируемого белка была показана для мРНК, вводимой s.c. [90,91,92]. Интересно, что иногда измерялась более эффективная трансляция по сравнению с системами доставки на основе мРНК-нагруженных наночастиц [90,93]. Таким образом, он обходит необходимость использования носителей, что в конечном итоге способствует снижению затрат и потенциального риска. Еще одним преимуществом введения вакцин на основе мРНК через s.c. маршрут является то, что индуцируются как клеточные, так и гуморальные иммунные ответы [94], поскольку мРНК экспрессируется как резидентными коже DC [95], так и неиммунными клетками [96]. Однако самый внешний слой рогового слоя эпидермиса служит плотным барьером для абсорбции местно вводимых лекарств [97]. До сих пор для преодоления этого барьера использовались различные подходы, включая физические (например, микропорация [98], микроиглы [99] и струйная инъекция [100,101]), активные (например, электропорация [102], ионофорез [103] и сонофорез [104]) и пассивные методы (например, наночастицы [105] и липосомы [106]). Электропорация и сонопорация могут временно пермеабилизировать кожу с помощью электрических импульсов и низкочастотного ультразвука, соответственно, для эффективной доставки генов в кожу [107]. Модифицированный мРНК-кодирующий фактор роста эндотелия сосудов-А был сформулирован в цитратно-буферном физиологическом растворе без использования системы доставки и использовался для внутривенной вакцинации пациентов с сахарным диабетом 2 типа [108]. Однако, несмотря на выраженную, устойчивую, дозозависимую и специфичную для груза вазодилатацию, увеличение кровотока, кислородно-метаболическую регуляцию, ангиогенез и образование неовессела на животных моделях, сосудорасширяющая и ангиогенная активность не передавалась людям [108, 109]. Доставка на основе микроигл также является эффективным методом, при котором используются игольчатые пластыри микронного размера/ массивы, состоящие из водорастворимых полимерных или сахарных наполнителей, в которые встраивается мРНК [76]. Пластыри / массивы обеспечивают механическую прочность, необходимую для проникновения иглы в роговой слой и проникновения в жизнеспособные слои кожи. После инъекции, в зависимости от типа микроигл, пластыри / массивы деградируют / растворяются, и инкапсулированное лекарственное средство высвобождается в интерстициальной жидкости кожи [75]. Введение мРНК с использованием растворимых микроигл обеспечивает важное преимущество, т.е. Доставка в твердой лекарственной форме позволяет обойти необходимость иметь дело с мРНК в жидкой лекарственной форме [110], что, следовательно, устраняет угрозу, исходящую от загрязнения РНКазой, наряду с увеличением стабильности мРНК и срока годности [76]. Было показано, что эндоцитоз, опосредованный рецептором-поглотителем, и микропиноцитоз являются активными механизмами поглощения голой мРНК в незрелых ДК [16]. Однако голая мРНК имеет короткий период полураспада в плазме, подвержена деградации рибонуклеазы и сталкивается с трудностями при попадании в клетку. Поэтому системы доставки были предложены для защиты мРНК и экранирования ее отрицательного заряда.4.2.2. Вирусные векторы
Доставка мРНК может быть опосредована вирусными и невирусными векторами. Невирусные векторы могут быть дополнительно классифицированы на системы доставки на основе липидов, системы доставки на основе полимеров и липидно-полимерные гибридные системы [111]. Для доставки вирусной РНК существует большой интерес к разработке адено-ассоциированных вирусов для перевозки грузов нуклеиновых кислот [112]. Генетически модифицированные вирусы обычно используются для доставки мРНК /генов. Гены этих вирусов частично или полностью заменяются модельными или терапевтическими генами. Преимущество РНК-вирусов заключается в том, что они реплицируются и экспрессируются локально в цитоплазме. Вирусы с положительной цепью РНК отличаются геномной последовательностью, которая может быть переведена непосредственно в интересующие белки рибосомами хозяина. Примечательно, что для доставки мРНК использовались альфавирусы (например, вирус Синдбиса и Семлики) [113], пикорнавирусы [114] и флавивирусы [115] (например, вирус Куньцзиня). Различные альфавирусные векторы могут быть использованы для экспрессии высоких уровней экзогенного белка в широком спектре хозяев [116]. Обычно используемые подходы включают прямую замену структурных генов гетерологичной экспрессией или размещение неструктурных генов ниже субгеномного промотора РНК [117]. Однако альфавирусы вызывают тяжелые цитопатогенные эффекты, которые ограничивают их применение в генной терапии, хотя для преодоления этой проблемы могут быть использованы различные стратегии [118]. Некоторые из этих стратегий включают разработку мутантных векторов со сниженной цитотоксичностью и индуцируемостью к температуре, а также самоинактивирующихся векторов с точечными мутациями в гене nsP2 (особенно в позициях 726, 259 и 650) [119]. Вирус Сендай (SeV) (вирус мышиного парагриппа типа 1 или гемагглютинирующий вирус Японии), относящийся к семейству Paramyxoviridae, заслуживает упоминания благодаря его популярному применению в качестве вектора. Он известен своими высокими, но транзиторными уровнями экспрессии генов, широкой специфичностью клеток-хозяев, низкой патогенностью и сильной иммуногенностью [120]. В качестве вакцинной платформы особый интерес представляет вирус венесуэльского энцефалита [121]. Эти вакцины включают живую аттенуированную вирусную вакцину TC-83 и инактивированную формалином ее разновидность C-84, которая повышает эффективность и увеличивает продолжительность иммунитета при введении вакцины TC-83 различными путями введения, наиболее широко используемыми интраназально [122]. Однако использование вирусных векторов сопряжено с серьезными недостатками, связанными, в частности, с интеграцией генома и возможным отторжением хозяина (иммуногенность и цитотоксичность) [123], что провоцирует необходимость в невирусных векторах для доставки мРНК [10].
Последний раз редактировалось: dimslav (Вт Май 24, 2022 12:48 pm), всего редактировалось 1 раз(а) (Обоснование : Текст отредактирован полностью Дмитрием)
dimslav- Сообщения : 12381
Дата регистрации : 2017-04-29
Возраст : 55
Re: Возможности и проблемы доставки вакцин на основе мРНК
- 4:
4.2.3. Векторы на основе полимеров
Диэтиламиноэтил (DEAE) декстран был первым полимером, который был протестирован в качестве реагента доставки мРНК IVT [124]. Позже было показано, что липид-опосредованная трансфекция мРНК в 100-1000 раз эффективнее, чем DEAE-декстран [125]. Это открытие остановило прогресс полимерных носителей и проложило путь для реактивов трансфекции на основе липидов для нуклеиновых кислот, включая мРНК. Комплексное исследование сравнило полимеры поли-бета-аминоэфиры (PBAE) и полиэтиленимин (PEI) с коммерческим трансфекционным реагентом Lipofectamine 2000 и 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний пропан (DOTAP) / 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин (DOPE) для функциональных, антиген-специфические Т-клеточные ответы после доставки мРНК [126]. Все носители комплексовали с мРНК, кодирующей антиген ВИЧ-1 gag. Gag-специфические, секретирующие IFN-γ Т-клетки были измерены в селезенке и лимфатических узлах мышей, иммунизированных мРНК gag в комплексе с катионными липидами, но не у мышей, иммунизированных голой и полимер-комплексной мРНК. PEI и его производные являются одними из наиболее часто используемых катионных полимеров [127]. Они растворимы в воде, обладают высокой плотностью положительного заряда, связанного с аминогруппами, и являются проверенными носителями мРНК для трансфекции in vitro [128]. Однако PEI проявляет проблемы токсичности из-за высокой молекулярной массы (> 25 кДа), которая может возникнуть в результате адсорбции анионных сывороточных белков на поверхность полиплекса между катионными полимерами и анионными белками плазмы сыворотки. Однако результирующее увеличение размера является лишь временным, поскольку белки, адсорбированные на поверхности полиплексов, предотвращают агрегацию частиц в долгосрочной перспективе [129]. Для смягчения этих проблем были предприняты различные усилия. Первое доказательство концепции безопасной и эффективной трансфекции мРНК-вакцины с использованием катионного полимера было получено путем интраназального введения 2 кДа PEI, конъюгированного с циклодекстрином. Циклодекстрин, конъюгированный с PEI, позволял делокализовать плотность заряда на полиаминовом остове, следовательно, снижая цитотоксичность и в то же время сохраняя протонируемые группы, что приводило к улучшению трансфекции [130]. Полимерные наночастицы, состоящие из биоразлагаемых полимеров, например, поли (молочнокисло-co-гликолевая кислота) (PLGA), хорошо подходят для включения гидрофобных и положительно заряженных молекул. Они обеспечивают хорошую коллоидную стабильность, низкую токсичность и возможность пролонгированного высвобождения. Однако из-за анионной природы PLGA при физиологическом рН [131] эффективность инкапсуляции мРНК очень низкая. Полимерные носители обладают значительным потенциалом для генной терапии благодаря значительной эффективности трансфекции и переносимой токсичности [132]. Серия многофункциональных блок-сополимеров, т.е. диметиламиноэтилметакрилат (DEAAMA), поли (этиленгликоль) метакрилат и DEAEMA-co-n-бутилметакрилат, продемонстрировала эффективность трансфекции 77% и 50% в необработанных 264,7 макрофагах и DC2.4 дендритных клетках соответственно, тем самым демонстрируя потенциал в качественоситель для внутриклеточной доставки вакцин на основе мРНК [133]. Несмотря на то, что были протестированы различные типы полимеров и сополимеров, корреляция между структурой полимеров и их биологическим ответом, например, трансфекцией и токсичностью, оказалась слабой, и поэтому проектирование различных систем доставки на основе полимеров опирается на эмпирические, а не рациональные подходы [134]. Несмотря на упомянутые выше преимущества, системы доставки на основе полимеров не столь клинически развиты, как системы доставки на основе липидов, из-за их полидисперсности и проблем, связанных с метаболизмом крупномолекулярных полимеров [21].4.2.4. Векторы на основе липидов
Векторы на основе липидов или липидоподобных соединений (липидоидов) представляют собой наиболее часто используемые невирусные носители генов [21]. Различные синтетические и природные липиды использовались для формирования липосом (комплексы липосом и нуклеиновых кислот называются липоплексами) или липидных наночастиц (LNP), которые, как сообщалось, эффективно доставляют вакцины на основе мРНК (таблица 2). LNP часто формулируются с использованием катионных липидов, отображающих третичные или четвертичные амины, для инкапсуляции полианионной мРНК. Катионные липиды спонтанно инкапсулируют отрицательно заряженную мРНК, опосредованную комбинацией привлекательных электростатических взаимодействий с РНК и гидрофобных взаимодействий, и, таким образом, используются отдельно или в комбинации для липофекции мРНК. Впервые сообщалось об использовании LNPs в качестве системы доставки мРНК в 2015 году, когда система доставки состояла из ионизируемого катионного липида / фосфатидилхолина / холестерина / ПЭГ-липида в соотношении (50: 10: 38,5: 1,5 моль / моль) [86]. Примеры катионных липидов включают, например, 1,2-ди-О-октадеценил-3-триметиламмоний пропан (DOTMA) [135], DOTAP [136] и цвиттерионный ДОПИНГ [137,138]. Они структурно обозначаются катионной головной группой, гидрофобной хвостовой группой и связующей группой между ними [139]. Однако наблюдалось, что катионные липиды проявляют провоспалительные реакции и нежелательные побочные эффекты [140]. Поэтому нейтральные липиды также включаются в катионные липосомы для снижения токсичности и достижения высоких уровней трансфекции in vivo [106]. Механизм LNP-опосредованной доставки мРНК до конца не изучен, но предполагается, что LNP интернализуются эндоцитозом и присоединяются электростатически и сливаются с клеточной мембраной через инвертированные небислойные липидные фазы [21].Таблица 2
Примеры систем доставки наночастиц для доставки мРНК.
Открыть в отдельном окне[th]Системы доставки лекарств[/th][th]Состав[/th][th]РНК[/th][th]Заболевание / состояние[/th][th]Список литературы[/th] Полимеры Поли (гликоамидоамин) мРНК эритропоэтина (ЭПО) Анемия и миелодисплазия [168] Полиэтиленгликоль ВИЧ-1 gag mRNA ВИЧ [169] Поли (β-аминоэфир) (PBAE) eGFP mRNA N/A [170] Триблок сополимер (включающий DMAEMA, PEGMA, DEAEMA и BMA) eGFP и овальбумин N/A [171] DEAE-Декстран мРНК, кодирующая люциферазу N/A [172] Липиды DOTAP/DOPE HxB-2 ВИЧ-1 Gag антиген мРНК ВИЧ [126] DOPE / DC-Холестерин [2:1] eGFP mRNA N/A [106] DOTAP / Липосома холестерина [1:1] с DSPE-PEG и DSPE-PEG-AA мРНК тимидинкиназы HSV I Рак [142] C12-200: Холестерин: ДОПИНГ: C14-PEG2000 мРНК ЭПО N/A [157] A18 Овальбуминовая мРНК Меланома [173] cKK-E12 мРНК антитела HER2 Рак [174] (6Z, 9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил 4-(диметиламино) бутаноат (MC3), DSPC, холестерин и 1,2-димиристоил-rac-глицерин, метоксиполиэтиленгликоль (PEG2000-DMG) Эритропоэтин человека [175] DOTAP /DOPE [1:1] Антиген ВИЧ-1 Gag mRNA ВИЧ [126] 3β-[N-(N’, N’-диметиламиноэтан) карбамоил] (DC-холестерин)/ДОПИНГ (1:2) eGFP mRNA N/A [106] Липидно-полимерные гибридные НПВ TT3: ДОПИНГ: Холестерин: DMG-PEG2000 с ядром PLGA мРНК люциферазы светлячка (FLuc) и мРНК eGFP N/A [160] PBAE: C14-PEG2000 FLuc мРНК N/A [161] PBAE: EDOPC/DOPE / DSPE-PEG Овальбуминовая мРНК N/A [176] PBAE: DOPC, DOTAP и DSPE-PEG eGFP mRNA N/A [105] Пептиды и пептидно-полимерные гибриды PepFect14 eGFP mRNA Рак яичников [164] RALA eGFP mRNA
OVA mRNAN/A [165] RALA-PLA eGFPmRNA
FLuc mRNAN/A [167]
BMA: бутилметакрилат; DEAE: диэтиламиноэтил; DEAEMA: диэтиламиноэтил метакрилат; DMAEMA: диметиламиноэтилакрилат; DOPE: диолеоилфосфатидилэтаноламин; DOTAP: диолеоил-3-триметиламмоний пропан; DSPC: дипальмитоилфосфатидилхолин; DSPE-PEG: 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[амино (полиэтиленгликоль); DSPE-PEG-AA: DSPE-PEG-анизамид; eGFP: усиленный зеленый флуоресцентный белок; HER2: рецептор эпидермального фактора роста человека 2; ВИЧ: вирус иммунодефицита человека; ВПГ: вирус простого герпеса; N/ A: неприменимо; PEGMA: поли (этиленгликоль) метакрилат; PLGA: поли(молочно-со-гликолевая кислота); TT: N1, N3, N5-трис(2-аминоэтил) бензол-1,3,5-трикарбоксамид; PLA: полимолочная кислота.
Липосомы представляют собой замкнутые мембранные структуры, которые образуются путем самосборки при диспергировании фосфолипидов в водных системах [141]. Они состоят по меньшей мере из одного фосфолипидного бислоя, который имитирует структуру клеточной мембраны, заключающей в себе водное ядро [8]. Сообщалось, что DOTAP / DOPE в молярном соотношении 1: 1 является эффективным трансфекционным агентом для мРНК, кодирующей антиген ВИЧ-1 Gag, который успешно индуцирует антиген-специфический иммунный ответ in vivo у мышей [126]. Кроме того, 3β-[N-(N’, N’-диметиламиноэтан) карбамоил] (DC)-холестерин) / липосомы на основе ДОПИНГА в соотношении [1: 2] достигли высокой эффективности инкапсуляции усиленной мРНК зеленого флуоресцентного белка (eGFP) наряду с высокой экспрессией eGFP in vitro [106]. Кроме того, дополнительный многокомпонентный LNP проявлял эффект подавления опухоли при загрузке тимидинкиназой вируса простого герпеса I (HSV I), кодирующей мРНК. LNP состояли из липосом DOTAP / Холестерин [1:1] наряду с 1,2-дистеароил-фосфатидилэтаноламин (DSPE)-полиэтиленгликоль (PEG) и DSPE-PEG-анизамид (AA) [142]. Принцип, лежащий в основе их эффективности, можно резюмировать как комбинацию электростатических взаимодействий, связанных с противоположными зарядами, и гидрофобных взаимодействий с мРНК. Кроме того, возможности выхода эндосом и свойства самосборки, приводящие к равномерным слоям, охватывающим полимерные ядра, также способствуют широкому применению катионных липидов [143]. Однако исследования in vivo являются более сложными из-за быстрой элиминации катионных липидов мононуклеарной фагоцитарной системой [144]. Катионные липиды, состоящие только из одной головной группы четвертичного аммония, создают проблемы безопасности, такие как токсичность и иммуногенность in vitro [145] и in vivo [146]. Например, катионные липосомы при внутривенном введении могут индуцировать гепатотоксичность [147] и могут вызывать сильный IFN-γ-ответ у мышей, приводящий к воспалению [148,149]. Кроме того, положительно заряженные липиды, например DOTAP и DOTMA, могут быть нейтрализованы анионными сывороточными белками, что приводит к токсичности и снижению эффективности [150]. Кроме того, могут возникнуть такие проблемы, как неограниченное связывание белков, коллоидная нестабильность и утечка лекарств [151].
В качестве альтернативы были введены новые векторы доставки генов, содержащие ионизируемые липиды [152] и липидоподобные материалы, называемые липидоидами [153], для преодоления проблем, связанных с обычными катионными липидами, сохраняя при этом их выгодные трансфекционные свойства. Ионизируемые липиды для трансфекции мРНК положительно заряжены при низком рН (что способствует комплексообразованию мРНК при его проведении в кислом буфере), но нейтральны при физиологическом рН (для снижения токсичности после инъекции) [154]. В отличие от обычных катионных липидов, эти липидоиды демонстрируют ряд вторичных и третичных аминов, позволяющих более эффективно взаимодействовать с мРНК без значительного увеличения общего заряда системы доставки [155]. Инкапсуляция мРНК в наночастицы служит для физической защиты нуклеиновых кислот от деградации и в зависимости от специфической химии может помочь в клеточном поглощении и эндосомальном побеге [156]. Комбинация ионизируемого липида C12-200, холестерина, допинга и C14-PEG2000 в молярном соотношении 3,5:4,65:1,6:0,25 соответственно, инкапсулирующая мРНК эритропоэтина (ЭПО-мРНК), показала высокую эффективность in vivo при введении мышам, измеренную как клеточная экспрессия ЭПО [157]. Акцент на платформу наночастиц для доставки мРНК частично обусловлен применением установленных систем доставки ДНК и миРНК.4.2.5. Липидно-полимерные гибридные наночастицы
Ранее было продемонстрировано, что липидно-полимерные гибридные наночастицы (LPN) демонстрируют эффективную функциональную доставку siRNA in vitro [158] и терапевтическую доставку siRNA in vitro и in vivo [159]. Эта гибридная система доставки также показала многообещающие результаты для доставки мРНК, причем мРНК инкапсулируется в гибридную наночастицу, состоящую из липидоподобного материала N1, N3, N5-трис (2-аминоэтил)бензол-1,3,5-трикарбоксамида (TT) в TT3: ДОПИНГ: Холестерин: DMG-PEG2000(1,2-димиристоил-sn-глицерин, метоксиполиэтиленгликоль) с полимерным ядром PLGA [160]. Кроме того, оптимизированные LPN, состоящие из разлагаемого полимера PBAE, сформулированного с PEG-липидом C14-2000, показали успешную доставку мРНК в легкие [161]. Это, наряду с сообщаемой совместной доставкой siRNA и mRNA с липидоидными полимерными гибридными наночастицами [162], показывает, что LPN являются новой системой доставки нуклеиновых кислот. Гибридная рецептура термодинамически благоприятна в отношении гидрофобных, ван-дер-ваальских и электростатических взаимодействий [80]. Несколько липидов и полимеров были исследованы для получения стабильных липидных частиц нуклеиновых кислот с использованием этой системы доставки. Наиболее распространенными используемыми полимерами являются PLGA, поликапролактон, полимолочная кислота или их комбинации, тогда как используемые липиды включают DOTAP, 1,2-дилауроил-sn-глицеро-3-фосфохолин, 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин, лецитин, DSPE и ПЭГ, среди других. Структурно на основе малоугольного рентгеновского рассеяния и криогенной просвечивающей электронной микроскопии предполагается, что эти наночастицы представляют собой полимерное матричное ядро с пластинчатыми липидными структурами с локализованной в ядре и в короне нуклеиновой кислотой [163].4.2.6. Векторы на основе пептидов
Системы на основе пептидов для доставки мРНК набирают обороты благодаря универсальности, которую могут предложить пептиды. В литературе сообщалось о системах доставки на основе пептидов, как отдельно, так и в сочетании с другими материалами, такими как полимеры. В исследовании, посвященном терапии рака яичников, коммерчески доступный проникающий в клетки пептид (CPP) PepFect14 комплексировался с мРНК eGFP посредством привлекательных электростатических взаимодействий [164]. Эта композиция наночастиц была более эффективной при трансфекции мРНК eGFP в клетки, связанные с раком яичников, чем коммерчески доступный липофектамин MessengerMAX. Аналогичным образом CPP RALA использовался для эффективной доставки как eGFP, так и OVA-мРНК и, как было продемонстрировано, превосходил катионный липид DOTAP и фузогенный липидный ДОПИНГ [165]. Однако современные ограничения включают целевую доставку клеток [164] и короткий период полувыведения из-за низкой стабильности в сыворотке-содержащей среде [166].
Недавно была представлена новая полимерно-пептидная гибридная наноплатформа доставки мРНК [167], сочетающая в себе мицеллы на основе полимеров (PLA) и катионный фузогенный пептид (RALA) для достижения соответствующей разлагаемости, стабильности мРНК и эндосомолитических свойств для трансляции. Сообщалось, что он защищает eGFP, а также FLuc мРНК от деградации сывороточной нуклеазы и достигает трансфекции DC. Действительно, векторы и гибриды на основе пептидов являются многообещающими и интересными дополнениями к различным существующим невирусным носителям для доставки мРНК.4.3. Клеточно-специфическая доставка мРНК
Клеточно-специфическая доставка мРНК была бы полезна для развития терапии на основе мРНК. Это может усилить доставку молекул мРНК к клеткам-мишеням и, следовательно, уменьшить требуемую дозу мРНК, а также уменьшить потенциальные нецелевые эффекты. Сообщалось, что лимфоидные органы могут быть нацелены путем регулировки чистого заряда препарата [177]. Это основано на принципе нахождения АСУ ТП вблизи Т-клеток в этих органах, что обеспечивает оптимальные условия для эффективного праймирования и амплификации Т-клеточных ответов. Было показано, что сайт-специфическая доставка мРНК-нагруженных наночастиц посредством активного таргетинга приводит к индукции сильных эффекторных и Т-клеточных ответов памяти и опосредованию мощного IFN-α-зависимого отторжения прогрессирующих опухолей, как это наблюдается с РНК. В другом исследовании клеточно-специфическая доставка мРНК FLuc и IL-10 к лейкоцитам (Ly6c+) была достигнута путем покрытия полученных мРНК-содержащих ЛНП моноклональными антителами против L6c+ [178]. Альтернативно, ДК и макрофаги экспрессируют рецепторы со способностью презентировать антигены, например лектиновые рецепторы С-типа [179], которые распознают сахарные группы, такие как маннозо- и фукозо-концевые гликаны [180] и опосредуют эндоцитоз модифицированных маннозой наночастиц. Это было использовано для трансфекции мРНК GFP в DC путем самосборки конъюгатов манноза-холестерин с различными ПЭГ-единицами в качестве линкеров [181].
Перейти к:5. Выводы и перспективы на будущее
Область терапии на основе мРНК охватывает от заместительной терапии белками и редактирования генов до вакцинации. Поскольку десятки кандидатов на основе мРНК в настоящее время находятся на доклинической и клинической стадиях разработки, очевидно, что технология вакцин на основе мРНК является перспективным инструментом для разработки новых терапевтических и профилактических вакцин против инфекционных заболеваний и рака. Однако разнообразные препятствия, связанные с чрезвычайно большим размером мРНК, зарядом, внутренней нестабильностью и высокой восприимчивостью к ферментативной деградации, препятствуют переводу терапии на основе мРНК со скамейки на кровать. Таким образом, более широкое применение терапии на основе мРНК все еще ограничено потребностью в улучшенных векторах или системах доставки лекарств. Передовые системы доставки могут быть применены для преодоления плохой стабильности, нацеливания на клетки и трансляционной эффективности голой мРНК. Однако многие клинически протестированные кандидаты на мРНК-вакцины сформулированы без какой-либо системы доставки, что предполагает необходимость дальнейшего совершенствования систем доставки мРНК-вакцин. В настоящее время для доставки мРНК в основном используются липоплексы и наночастицы на основе липидов. Кроме того, полимеры и липидно-полимерные гибридные наночастицы предлагают большие перспективы с точки зрения безопасности, стабильности, высокой эффективности трансфекции и низкой цены. Дальнейшее развитие формулировки и доставки мРНК с использованием различных наноматериалов может улучшить более широкое использование мРНК для лечения и профилактики инфекционных заболеваний и рака.
dimslav- Сообщения : 12381
Дата регистрации : 2017-04-29
Возраст : 55
Похожие темы
» Чарльз Хоффе Проблемы с сердцем из-за вакцин мРНК, убьют большинство вакцинированных
» Разговор с изобретателем мРНК/ДНК вакцин - Робертом Мэлоуном.
» Латыпова САША Оценка призыва доктора Ладапо остановить уколы от ковид-19 мРНК на основе фальсификации
» Фабио Дж . К. Каризио Внутри вакцин с мРНК молекула человека дьявольски изменена
» Главный хирург штата Флорида призывает прекратить использование вакцин с мРНК COVID-19
» Разговор с изобретателем мРНК/ДНК вакцин - Робертом Мэлоуном.
» Латыпова САША Оценка призыва доктора Ладапо остановить уколы от ковид-19 мРНК на основе фальсификации
» Фабио Дж . К. Каризио Внутри вакцин с мРНК молекула человека дьявольски изменена
» Главный хирург штата Флорида призывает прекратить использование вакцин с мРНК COVID-19
Школа Души Божественного Космоса :: В поисках правды: инсайдеры и теории заговоров :: Разоблачители коронамракобесия
Страница 1 из 1
Права доступа к этому форуму:
Вы не можете отвечать на сообщенияПоднимись к оглавлению форума
|
|
Сегодня в 2:21 pm автор dimslav
» Реальная история с Мелиссой Эп 65 Кто такой доктор Джеймс Джордано 16 мая 2024 года
Сегодня в 11:41 am автор dimslav
» Михаил Кузнецов - Что нас ждет за порогом смерти?
Сегодня в 9:34 am автор Admin
» Михаил Кузнецов - Пророчества об Эре Водолея.
Сегодня в 9:31 am автор Admin
» АНА МАРИЯ МИХАЛЧА И МАРИЯ ЗИИ
Сегодня в 8:26 am автор dimslav
» АНА МАРИЯ МИХАЛЧА Опасности ЭМП-излучения - Беседа с мировым экспертом по ЭМП-излучению профессором доктором Олле Йоханссоном - Истина, наука и дух: Эпизод 20
Сегодня в 8:25 am автор dimslav
» Фриц Шпрингмайер Оккультная нумерология Символы, коды для контроля сознания, ритуальные дни иллюминатов
Сегодня в 8:03 am автор dimslav
» КОРРЕСПОНДЕНТ СПЕЦИАЛЬНЫЙ РЕПОРТАЖ С КЕРРИ КЭССИДИ И ДЖЕЙНОМ КЛАУДОМ - 1 АПРЕЛЯ
Сегодня в 7:57 am автор dimslav
» КЕРРИ КЭССИДИ БЕРЕТ ИНТЕРВЬЮ У ГЕЙЛ О САМОИСЦЕЛЕНИИ ГАЙИ И ТЕКУЩИХ СОБЫТИЯХ
Сегодня в 7:51 am автор dimslav
» FESIG 121 Доктор Кэти Форти _ Математические коды для самовосстановления ДНК С Дж.Ринком
Чт Май 16, 2024 6:41 am автор dimslav
» Джордан Максвелл Одно из его последних видео Бог показывает Моисею свою задницу
Чт Май 16, 2024 4:16 am автор dimslav
» СПЕЦИАЛЬНЫЙ РЕПОРТАЖ ВОЕННОГО КОРРЕСПОНДЕНТА КЕРРИ КАССИДИ И ЖАН-КЛАУД 14 МАЯ 2024
Ср Май 15, 2024 1:11 pm автор dimslav
» Михаил Кузнецов - Косвенные признаки Матрицы
Ср Май 15, 2024 12:59 pm автор Admin
» Брэдли Любящий 2024 05 02 LoveTruthSite Подкаст N°115 СПЕКУЛЯТИВНОЕ ОБОЗРЕНИЕ Разоблачение Ким Гоген от Бредли
Ср Май 15, 2024 7:54 am автор dimslav
» Звезда Ярилы. Путь к совершенству Человека на Земле
Ср Май 15, 2024 7:54 am автор Akriv
» Проект "Камелот" Валерий Уваров
Ср Май 15, 2024 7:50 am автор dimslav
» АНА МАРИЯ МИХАЛЧА Удивительные кадры из крови Darkfield Live С Нано / микроробот В невакцинированной крови C19 И что сказал Рэй Курцвейл о нанороботах и Сингулярности?
Вт Май 14, 2024 9:33 pm автор dimslav
» Ана Мария Михалча Было ли известно науке, что полиэтиленгликоль (ПЭГ), ключевой ингредиент инъекций биологического оружия C19, может создавать самосборные нановолокна, сферы и мезогенные ДНК-биосенсоры? Да, с 2007 года
Вт Май 14, 2024 9:14 pm автор dimslav
» Ана Мария Михалча ГЛОБАЛЬНЫЙ МОЗГОВОЙ ЧИП И МЕЗОГЕННЫЕ наномашины для окончательного контроля ложных воспоминаний - Компьютерная система для коллективного контроля разума
Вт Май 14, 2024 9:09 pm автор dimslav
» АНА МАРИЯ МИХАЛЧА Микроскопия в режиме реального времени в режиме реального времени устройства для самосборки дискоидного мезогена В невакцинированной крови C19 в режиме реального времени
Вт Май 14, 2024 8:47 pm автор dimslav
» АНА МАРИЯ МИХАЛЧА Программируемые нанотехнологические биосенсорные мезогенные устройства "Компьютерный чип" самостоятельно собираются в неинъекционной крови C19? Насколько опасна самораспространяющаяся нанотехнология?
Вт Май 14, 2024 8:39 pm автор dimslav
» Maria ZEEE media
Вт Май 14, 2024 7:26 pm автор dimslav
» Украина на краю пропасти
Вт Май 14, 2024 4:05 pm автор dimslav
» Тьерри Мейсан Выборы в Европейский парламент: дорогостоящий маскарад
Вт Май 14, 2024 3:35 pm автор dimslav
» У Джеффри Эпштейна больше общего с Рэем Курцвейлом, чем вы думаете
Вт Май 14, 2024 7:48 am автор dimslav
» Кэрри Кэссиди и БРУКС АГНЬЮ - ЗАЗЕРКАЛЬЕ И ГРЯДУЩАЯ ИМПЕРИЯ
Вт Май 14, 2024 7:41 am автор dimslav
» Бенджамин Фулфорд - Еженедельный отчет от 13.05.2024
Вт Май 14, 2024 2:39 am автор dimslav
» БРУКС ЭГНЬЮ - МОЙ ГОСТЬ.КЕРРИ КЭССИДИ
Пн Май 13, 2024 6:53 am автор dimslav
» FESIG С ГОСТЯМИ СКОТТОМ ПЕРЕЗОМ И КЕРРИ КЭССИДИ
Пн Май 13, 2024 6:52 am автор dimslav
» Генри Макоу - Общество насыщено тайными сатанистами
Пн Май 13, 2024 3:08 am автор Admin
» Лиза Ренье - Солнечная Алхимия Овна Блог Изменяющиеся линии времени Апрель 2024
Вс Май 12, 2024 6:56 am автор Admin
» Неограниченная военная операция Эп. 90 | "Кровь, зараженная наноботами" с доктором Аной Михалчей и доктором Джозефом Сансоне
Сб Май 11, 2024 5:42 am автор dimslav
» Технократия и трансгуманизм - Беседа с Патриком Вудом - Истина, наука и дух Эпизод 19
Сб Май 11, 2024 5:40 am автор dimslav
» ДЖЕЙ ВАЙДНЕР, ЖАН-КЛОД И МЭГ : Шоу Трумана и пр документальные фильмы
Сб Май 11, 2024 5:23 am автор dimslav
» КЕРРИ КЭССИДИ НА ШОУ НИНО РОДРИГЕСА
Сб Май 11, 2024 5:16 am автор dimslav
» Роберт Дункан о нейротехнологиях, нацеленных на человечество секретности, необходимости перемен
Сб Май 11, 2024 5:09 am автор dimslav
» Джордан Максвелл ИИ, Синай, Секс, Луна, Моисей
Сб Май 11, 2024 5:05 am автор dimslav
» Вернон Коулман - Когда вы умрете, бороться с этой угрозой будет уже слишком поздно.
Сб Май 11, 2024 4:00 am автор Admin
» Питер Мейер - Искажение мудрости /2024/05/10/
Пт Май 10, 2024 11:54 pm автор Admin
» Михаил Кузнецов - Почему магнитная буря, которая приближается к Земле названа "каннибальской"?
Пт Май 10, 2024 11:29 pm автор Admin
» Макоу- Религиозные фанатики захватили Израиль (и США)
Пт Май 10, 2024 7:32 pm автор Admin
» Питер Мейер - Технологии атлантов 2024/05/07/
Пт Май 10, 2024 4:42 am автор Admin
» Питер Мейер - Сантьии ВЕДЫ ПЕРУНА 2/5/24
Пт Май 10, 2024 3:33 am автор Admin
» Михаил Кузнецов - Почему ВОЗ требует принятия кабального "пандемийного соглашения"?
Пт Май 10, 2024 3:08 am автор Admin
» Тьерри Мейсан Трактовка событий 7 октября опровергается фактами
Чт Май 09, 2024 9:31 pm автор dimslav
» Михаил Кузнецов - Работа с "этажами сознания". Третье внимание.
Чт Май 09, 2024 2:27 am автор Admin
» Михаил Кузнецов - Феномен предвидения будущего.
Ср Май 08, 2024 2:13 am автор Admin
» Михаил Кузнецов - Параллельные миры. Опасности мира сновидений.
Ср Май 08, 2024 2:10 am автор Admin
» УЭС ПЕНРЕ - СЕССИИ ВОПРОСОВ И ОТВЕТОВ Май-июнь 2024
Ср Май 08, 2024 1:01 am автор Admin
» Какое место должен занимать триколор на Параде Победы?
Вт Май 07, 2024 8:23 pm автор dimslav
» Тьерри Мейсан Сложные отношения Израиля с Ираном
Вт Май 07, 2024 7:40 pm автор dimslav
» Тьерри Мейсан Париж-2024 и Берлин-1936 во власти несбыточной имперской мечты
Вт Май 07, 2024 5:45 pm автор dimslav
» Бенджамин Фулфорд - Еженедельный отчет от 06.05.2024
Вт Май 07, 2024 3:29 am автор Admin
» Будков - русская цивилизация входит в управление миром
Пн Май 06, 2024 2:29 pm автор dimslav
» Саша Латыпова - третья пресс-конференция операции "Варп Спид"
Пн Май 06, 2024 1:14 pm автор dimslav
» Доктор Шанкара Четти 2024 новые интервью
Пн Май 06, 2024 9:36 am автор dimslav
» Джордан Максвелл - Сыны Божии. Критический Взгляд на Библию.
Пн Май 06, 2024 8:58 am автор dimslav
» Ана Михалча - Война против человечества - беседа с экспертом по оружию Марком Стилом - Истина, наука и дух, эпизод 16
Вс Май 05, 2024 8:37 pm автор dimslav
» АНА МАРИЯ МИХАЛЧА Поле битвы нашего разума и душевной связи - Обзор исследований разведывательного агентства в области "паранормальных явлений"
Вс Май 05, 2024 1:45 pm автор dimslav
» АНА МАРИЯ МИХАЛЧА Нанотехнологии, кибернетические коллективные умы, искусственный интеллект и контроль над разумом - интервью сотрудника DARPA и ЦРУ доктора Роберта Дункана подтверждают Возможность похищения человеческой души
Вс Май 05, 2024 1:41 pm автор dimslav
» АНА МАРИЯ МИХАЛЧА Исследования MIT в области наноэлектронных устройств Создают новые парадигмы симбиоза Жизни и Машины и академические связи с Глобальной технократической трансгуманистической сетью
Вс Май 05, 2024 1:26 pm автор dimslav
» Майкл Тсарион - Архитекторы Контроля. Массовый Контроль и Будущее Человечества
Вс Май 05, 2024 1:03 pm автор dimslav
» Марк Пассио - 11 сентября 2001 г. Магия Хаоса.
Вс Май 05, 2024 1:00 pm автор dimslav
» Марк Пассио – Демистификация Оккультного Знания.
Вс Май 05, 2024 12:57 pm автор dimslav
» Дэвид Айк - Правда о Сознании и Духовности
Вс Май 05, 2024 12:52 pm автор dimslav
» Дэвид Айк – Наведённый Сон + Искусственный Интеллект
Вс Май 05, 2024 12:49 pm автор dimslav
» Джордан Максвелл - Сыны Божии. Критический Взгляд на Библию.
Вс Май 05, 2024 12:44 pm автор dimslav
» Теренс МакКенна - Мем Муви
Вс Май 05, 2024 12:40 pm автор dimslav
» Дэвид Айк - Цензура, ЧМ по Футболу в России и Как Победить Систему
Вс Май 05, 2024 12:37 pm автор dimslav
» Предпоследняя правда о Филипе Дике
Вс Май 05, 2024 12:35 pm автор dimslav
» Айк и Роуз
Вс Май 05, 2024 12:32 pm автор dimslav
» Дэвид Айк - Почему Меня Не Могут «Убрать»
Вс Май 05, 2024 12:31 pm автор dimslav
» Дэвид Айк - Тайна Вселенной и ДМТ (Аяваска)
Вс Май 05, 2024 12:29 pm автор dimslav
» Дэвид Айк - Вакцина. Роуз Айк 5
Вс Май 05, 2024 12:27 pm автор dimslav
» Дэвид Айк - 9/11 и Операция "Нортвудс"
Вс Май 05, 2024 12:25 pm автор dimslav
» Дэвид Айк - Архонты, Сатурн и Лунная Матрица Full HD Version
Вс Май 05, 2024 12:23 pm автор dimslav
» Роуз Айк 2
Вс Май 05, 2024 12:15 pm автор dimslav
» Роуз Айк 7
Вс Май 05, 2024 12:14 pm автор dimslav
» Роуз Айк 9 Дэвид Айк
Вс Май 05, 2024 12:10 pm автор dimslav
» Дэвид Айк Мы живем в симуляции
Вс Май 05, 2024 12:09 pm автор dimslav
» Дэвид Айк Ударь по-крупному
Вс Май 05, 2024 12:07 pm автор dimslav
» Нанотехнологическая война против человечества, увиденная в живой крови - Беседа с наукой и духом Эпизод 18
Вс Май 05, 2024 11:58 am автор dimslav
» Ким Гоген 03.05.24
Вс Май 05, 2024 10:52 am автор dimslav
» Адаму хочет познакомиться с вами! _ Представляем вам "Душа в душу" с Адаму
Вс Май 05, 2024 7:25 am автор dimslav
» Серия 5, часть 1; Легенды о последнем Великом потопе и о том, как некоторые люди выжили после него
Сб Май 04, 2024 10:30 pm автор dimslav
» Микроскопия Растущий Графен под ультрафиолетом и высокими частотами от радио импульсов
Пт Май 03, 2024 11:16 am автор dimslav
» Дэвид Айк – Реинкарнация и Демоны Астрала
Пт Май 03, 2024 11:11 am автор dimslav
» Stop World Control КОНЕЦ ЧЕЛОВЕЧЕСТВА - Как планируют мировые лидеры
Пт Май 03, 2024 10:42 am автор dimslav
» Питер Мейер - Отчет о состоянии
Чт Май 02, 2024 4:10 pm автор Admin
» FESIG 123 Доктор Джон Скотт Перез о водородной энергетической системе и квантовой физике
Чт Май 02, 2024 4:07 pm автор dimslav
» Михаил Кузнецов - Как считывать информацию о прошлых событиях?
Чт Май 02, 2024 11:02 am автор Admin
» Нанотехнологии, превращающие нас в киборгов, реальны
Чт Май 02, 2024 6:06 am автор Admin
» Кто такая Темная Элита... (и кто такой Адаму) пришельцы раскрывают галактическое происхождение человечества
Вт Апр 30, 2024 9:44 pm автор dimslav
» Интервью Юрия Рошки с доктором Ана Мария Михалча
Вт Апр 30, 2024 9:24 pm автор Goxis07
» Джордан Максвелл рассказал о смерти Мэнли Пи Холла и их отношениях
Вт Апр 30, 2024 9:05 pm автор dimslav
» Бенджамин Фулфор - Еженедельный отчет за 29.04.2024
Вт Апр 30, 2024 2:13 am автор Admin
» ХИВ, Книга «Assassins» 411 Codex Icarus.
Вт Апр 30, 2024 12:05 am автор Admin
» FESIG 122 Д-р Скотт Перез Репликация хромосом, клонирование ДНК и редактирование генов
Пн Апр 29, 2024 6:56 am автор dimslav
» Гидеон - Разведданные #46 - Грядущее ложное пробуждение (включает вопросы и ответы)
Пн Апр 29, 2024 6:19 am автор Admin