Пилотное исследование содержания хлормеквата в пище и моче взрослых в США с 2017 по 2023 год

Пилотное исследование содержания хлормеквата в пище и моче взрослых в США с 2017 по 2023 год

• Алексис М. Темкин, 
  
  
• Сидни Эванс, 
  
  
• Деметри Д. Спиропулос & 
  
  
• Ольга В. Найденко 
  
  • подробности
    
    
  
  
  

Аннотация

Хлормекват хлорид - регулятор роста растений, применение которого на зерновых культурах в Северной Америке растет. Токсикологические исследования показывают, что воздействие хлормеквата может снизить фертильность и нанести вред развивающемуся плоду в дозах, меньших, чем те, которые используются регулирующими органами для установления допустимых суточных уровней потребления. Здесь мы сообщаем о присутствии хлормеквата в образцах мочи, взятых у людей в США, с частотой обнаружения 69%, 74% и 90% для образцов, взятых в 2017, 2018-2022 и 2023 годах, соответственно. Хлормекват был обнаружен в низких концентрациях в образцах с 2017 по 2022 год, со значительным повышением концентрации в образцах с 2023 года. Мы также наблюдали высокую частоту обнаружения хлормеквата в продуктах на основе овса. Эти результаты и данные о токсичности хлормеквата вызывают обеспокоенность по поводу текущих уровней воздействия и требуют проведения более масштабных тестов на токсичность, мониторинга пищевых продуктов и эпидемиологических исследований для оценки воздействия хлормеквата на здоровье человека.

Воздействие

• В этом исследовании впервые сообщается об обнаружении хлормеквата, сельскохозяйственного химиката, токсичного для развития и репродуктивной системы, среди населения США и в поставках продовольствия в США. Хотя аналогичные уровни химического вещества были обнаружены в образцах мочи, взятых с 2017 по 2022 год, заметно повышенные уровни были обнаружены в образцах, взятых с 2023 года. Эта работа подчеркивает необходимость более тщательного мониторинга содержания хлормеквата в пищевых продуктах США и образцах людей, а также токсикологических и эпидемиологических исследований хлормеквата, поскольку это химическое вещество является новым загрязнителем с документально подтвержденными неблагоприятными последствиями для здоровья при низких дозах в исследованиях на животных.
  
• Введение
  

[size]


Хлормекват хлорид - сельскохозяйственное химическое вещество, впервые зарегистрированное в США в 1962 году в качестве регулятора роста растений. Хотя в настоящее время в США разрешено использовать только на декоративных растениях, решением Агентства по охране окружающей среды США (EPA) от 2018 года разрешен импорт пищевых продуктов, в первую очередь зерновых, обработанных хлормекватом [1]. В Европейском союзе, Соединенном Королевстве и Канаде хлормекват хлорид одобрен для использования на пищевых культурах, в первую очередь на пшенице, овсе и ячмене. Действие хлормеквата уменьшает высоту стеблей, тем самым снижая вероятность перегиба урожая, что может затруднить сбор урожая. В Великобритании и Европейском союзе хлормекват часто является наиболее обнаруживаемым остатком пестицида в зерне и крупяных изделиях, что подтверждено мониторинговыми исследованиями, проводившимися в течение нескольких лет [2, 3].
Несмотря на то, что хлормекват был одобрен для применения на сельскохозяйственных культурах в Европе и некоторых частях Северной Америки, он проявляет относительно токсикологические свойства, что подтверждено историческими, а также недавно опубликованными исследованиями на лабораторных животных. В начале 1980-х годов датские свиноводы впервые описали влияние воздействия хлормеквата на репродуктивную токсичность и фертильность, которые наблюдали снижение репродуктивной функции у свиней, выращенных на зерне, обработанном хлормекватом [4]. Позже эти наблюдения были исследованы в контролируемых лабораторных экспериментах на свиньях и мышах, в результате чего у самок свиней, которых кормили зерном, обработанным хлормекватом, нарушался цикл течки и возникали трудности при спаривании по сравнению с животными, получавшими контрольную диету без хлормеквата [4]. Кроме того, у мышей-самцов, получавших хлормекват с пищей или питьевой водой во время развития, наблюдалось снижение способности сперматозоидов к оплодотворению in vitro [5]. Более поздние исследования репродуктивной токсичности хлормеквата показывают задержку наступления половой зрелости, снижение подвижности сперматозоидов, снижение массы мужских репродуктивных органов и снижение уровня тестостерона у крыс, подвергшихся воздействию в чувствительные периоды развития, в том числе во время беременности и в раннем возрасте [6,7,8]. Исследования токсичности для развития также предполагают, что воздействие хлормеквата во время беременности может нарушать регуляцию роста и метаболизма плода [9]. Другие исследования не выявили влияния хлормеквата на репродуктивную функцию у самок мышей, самцов свиней или последующего исследования способности к оплодотворению у самцов мышей, подвергшихся воздействию хлормеквата в период развития и постнатально [4, 10, 11]. Неоднозначные данные в токсикологической литературе по хлормеквату могут быть связаны с различиями в тестируемых дозах и измеренных результатах, а также с выбором модельного организма и полом лабораторных животных. Следовательно, требуется дальнейшее расследование.
Хотя недавние токсикологические исследования указывают на воздействие хлормеквата на развитие, репродуктивную функцию и эндокринную систему, механизм (ы), с помощью которого возникают эти токсикологические эффекты, до конца не изучен. Некоторые исследования показывают, что хлормекват, вероятно, не действует через хорошо изученные механизмы химических веществ, разрушающих эндокринную систему, в том числе через рецепторы эстрогена или андрогенов, и не изменяет активность ароматазы [12]. Другие данные свидетельствуют о том, что хлормекват может вызывать побочные эффекты из-за изменения биосинтеза стероидов и индукции стресса эндоплазматического ретикулума [8, 13].
Хотя хлормекват широко распространен в широко потребляемых продуктах питания в Европе, существует лишь относительно небольшое количество исследований биомониторинга, оценивающих воздействие хлормеквата на человека. Период полураспада хлормеквата в организме короткий - около 2-3 часов, при этом большая часть экспериментальных доз выводится в течение 24 часов на основе исследований с участием людей-добровольцев [14]. В общих выборках населения из Соединенного Королевства и Швеции хлормекват был обнаружен в моче почти у 100 процентов участников исследования с частотой и концентрациями, значительно более высокими, чем у метаболитов других пестицидов, таких как хлорпирифос, пиретроиды, тиабендазол и манкозеб [14,15,16,17]. Исследования на свиньях показывают, что хлормекват также может быть обнаружен в сыворотке крови, а также переноситься в молоко, но эти матрицы не были исследованы на людях или других лабораторных животных, хотя потенциальное присутствие химических веществ, связанных с репродуктивным ущербом, в сыворотке и молоке имеет важные последствия для воздействия во время беременности и на младенцев [18].
В апреле 2018 года Агентство по охране окружающей среды США опубликовало допустимые уровни пищевой переносимости хлормеквата хлорида в импортируемых овсе, пшенице, ячмене и некоторых продуктах животного происхождения, что разрешило импорт хлормеквата в продовольственные запасы США. Затем допустимые уровни были увеличены для овса в 2020 году. Чтобы охарактеризовать влияние этих решений на появление и распространенность хлормеквата среди взрослого населения США, в этом пилотном исследовании были измерены уровни хлормеквата в моче людей из трех географических регионов США с 2017 по 2023 год, а также уровни содержания хлормеквата в продуктах на основе овса и пшеницы, приобретенных в США в 2022 и 2023 годах.

[/size]

Материалы и методы

Образцы мочи человека

[size]
Для измерения содержания хлормеквата в моче людей, проживающих в США, были использованы стандартные образцы из трех географических регионов, собранные в период с 2017 по 2023 год. Двадцать один образец мочи, взятый в соответствии с протоколом, утвержденным Институциональным наблюдательным советом (IRB) в 2017 году у беременных женщин с деидентификацией во время родов, был получен Медицинским университетом Южной Каролины (MUSC, Чарльстон, Южная Каролина, США). Образцы хранились при температуре 4 ° C в течение 4 часов перед аликвотацией и замораживанием при -80 °C. Двадцать пять образцов мочи взрослых были приобретены в ноябре 2022 года у Lee Biosolutions, Inc (Мэриленд-Хайтс, Миссури, США) и представляют собой единичные образцы, собранные с октября 2017 по сентябрь 2022 года добровольцами (13 мужчинами и 12 женщинами), собранными в Мэриленд-Хайтс, Миссури. Образцы хранили при температуре -20 ° C сразу после сбора. Кроме того, 50 образцов мочи, взятых в июне 2023 года у добровольцев во Флориде (25 мужчин, 25 женщин), были приобретены у BioIVT, LLC (Уэстбери, Нью-Йорк, США). Образцы хранились при температуре 4 ° C до тех пор, пока все образцы не были собраны перед аликвотацией и замораживанием при -20 ° C. Компании-поставщики получили необходимое одобрение IRB для работы с образцами человека и согласие на забор образцов. Ни с одним из тестируемых образцов не было предоставлено никакой личной информации. Все образцы были отправлены замороженными для анализа. Подробную информацию о пробах можно найти в Дополнительной информации, таблица S1.
[/size]

Аналитическая методология

[size]
Хлормекват был количественно определен в образцах мочи человека методом ЖК-МС / MS в Научно-исследовательской лаборатории НИУ ВШЭ (Бакстон, Великобритания) в соответствии с методологией, опубликованной Lindh et al. 2011 с небольшими изменениями [14]. Вкратце, образцы были подготовлены путем смешивания 200 мкл нефильтрованной мочи с 1,8 мл 0,01 М ацетата аммония, содержащего внутренний стандарт. Затем образцы экстрагировали с помощью колонок HCX-Q, кондиционированных метанолом, затем 0,01 М ацетата аммония, промывали 0,01 М ацетата аммония и элюировали в метанол 1%-ной муравьиной кислотой. Затем образцы загружали на колонку C18 LC (Synergi 4 µ Hydro-RP 150×2 мм; Phenomenex, Великобритания) и разделяли с использованием изократической подвижной фазы, состоящей из 80:20 0,1% муравьиной кислоты: метанол при скорости потока 0,2 мл/мин. Выбранные переходы для мониторинга реакций масс-спектрометрией описаны в Lindh et al. 2011. Предел обнаружения составлял 0,1 мкг / л, как сообщалось в других исследованиях [14].
Концентрации хлормеквата в моче были указаны как мкмоль хлормеквата на моль креатинина и переведены в мкг хлормеквата на г креатинина, как выражалось в предыдущих исследованиях (умножено на 1,08).
Образцы продуктов питания на основе овса (25 обычных и 8 органических) и пшеницы (9 обычных), приобретенные в продуктовых магазинах США в районе метро Вашингтон, округ Колумбия, в июне и августе 2022 года, а также в феврале и мае 2023 года, были протестированы на содержание хлормеквата компанией Anresco Laboratories, LLC (Сан-Франциско, Калифорния, США). Образцы были проанализированы на основе опубликованных методик с изменениями [19]. LOD / LOQ были установлены на уровне 10/100 ppb и 3/40 ppb для образцов овса с 2022 года и для всех образцов пшеницы и овса с 2023 года соответственно. Подробную информацию о пробах можно найти в Дополнительной информации, таблица S2.
[/size]

Статистический анализ

[size]
Концентрации хлормеквата в моче были сгруппированы в зависимости от географического местоположения и года сбора, за исключением двух образцов из Мэриленд-Хайтс, Миссури, собранных в 2017 году, которые были сгруппированы с другими образцами 2017 года из Чарльстона, Южная Каролина. Образцы, в которых уровень обнаружения хлормеквата был ниже предела, рассматривались как LOD, деленный на квадратный корень из двух. Данные распределялись ненормально, поэтому для сравнения медиан между группами использовался непараметрический тест Крускала-Уоллиса с тестом множественных сравнений Данна. Все расчеты проводились в GraphPad Prism (Бостон, Массачусетс).

[/size]

Результаты

[size]
Хлормекват был обнаружен в 77 из 96, или 80% всех образцов мочи. Частота обнаружения была выше в образцах 2023 года по сравнению с образцами 2017 и 2018-2022 годов: 16 из 23, или 69%, 17 из 23, или 74%, и 45 из 50, или 90% обнаруженных образцов соответственно (Таблица 1). Обнаруженные концентрации хлормеквата были сопоставимы между двумя группами до 2023 года, в то время как концентрации, обнаруженные в образцах 2023 года, были значительно выше, чем в образцах предыдущих лет (рис. 1A, B). Концентрации в обнаруживаемых образцах варьировались от 0,22 до 5,4, от 0,11 до 4,3 и от 0,27 до 52,8 мкг хлормеквата на г креатинина в образцах 2017, 2018-2022 и 2023 годов соответственно. Средние значения по всем образцам составили 0,46, 0,30 и 1,4 для образцов 2017, 2018-2022 и 2023 годов соответственно (таблица 1). Эти данные указывают на вероятное непрерывное воздействие, учитывая короткий период полураспада хлормеквата in vivo, с низкими уровнями с 2017 по 2022 год и более высокими уровнями воздействия в 2023 году.
Таблица 1 Сравнение концентраций хлормеквата в моче между исследованиями.
[/size][size]

Рис. 1: Концентрации хлормеквата в моче лиц, проживающих в США, в три временных периода.

Концентрации хлормеквата для каждого отдельного образца мочи представлены одиночными точками со столбиками среднего значения и погрешности, представляющими + / - стандартную ошибку. Концентрация хлормеквата в моче выражена в мкг хлормеквата на г креатинина по линейной шкале (A) и логарифмической шкале (B). Непараметрический ANOVA Крускала-Уоллиса с тестом множественных сравнений Данна использовался для проверки статистической значимости (***p < 0,001, ****p <0,0001).

[/size][size]

Образцы пищевых продуктов, приобретенные в США в 2022 и 2023 годах, показывают обнаруживаемые уровни хлормеквата во всех из 25 традиционных продуктов на основе овса, кроме двух, с концентрациями от необнаруживаемых до 291 мкг / кг, что указывает на высокую распространенность хлормеквата в овсе. Средние уровни были одинаковыми в образцах, собранных в 2022 и 2023 годах, - 90 и 114 мкг / кг соответственно. Только в одном образце из восьми органических продуктов на основе овса содержание хлормеквата было обнаружено в концентрации 17 мкг / кг. Мы также наблюдали низкие концентрации хлормеквата в двух из девяти протестированных продуктов на основе пшеницы - 3,5 и 12,6 мкг / кг (таблица 2).
Таблица 2 Содержание хлормеквата в продуктах на основе овса и пшеницы, приобретаемых в продуктовых магазинах США.
[/size]

Обсуждение

[size]
Это первый отчет об измерениях содержания хлормеквата в моче у взрослых, проживающих в США, и у любого населения за пределами Соединенного Королевства и Швеции. В ходе биомониторинга пестицидов у более чем 1000 подростков из Швеции была подтверждена 100-процентная частота обнаружения хлормеквата в период с 2000 по 2017 год. Средние концентрации в 2017 году составляли 0,86 мкг хлормеквата на г креатинина и, по-видимому, снижались с течением времени, самый высокий средний уровень составлял 2,77 в 2009 году [16]. В Великобритании с 2011 по 2012 год биомониторинг выявил гораздо более высокие средние концентрации - 15,1 мкг хлормеквата на г креатинина, и хотя эти образцы были взяты у людей, проживающих в сельскохозяйственной зоне, не было различий в воздействии при сравнении уровней до и после распыления хлормеквата [15]. По сравнению с этими предыдущими исследованиями в Европе средние уровни, измеренные в нашем исследовании образцов из США с 2017 по 2022 год, были ниже, в то время как средний уровень в образцах из 2023 года был сопоставим с образцами из Швеции и ниже, чем в образцах из Великобритании (таблица 1).
Различия в воздействии между этими различными регионами и временными точками, вероятно, отражают различия в сельскохозяйственной практике и нормативном статусе хлормеквата, что в конечном итоге влияет на уровень хлормеквата в продуктах питания. Например, значительно более высокие концентрации хлормеквата в образцах мочи в 2023 году по сравнению с предыдущими годами могут отражать вероятное недавнее попадание хлормеквата в продовольственные запасы США из-за изменений в нормативных актах EPA, касающихся хлормеквата, включая установление ограничений на содержание хлормеквата в продуктах питания в 2018 году и повышение этих ограничений для овса в 2020 году. Эти действия разрешили импорт и продажу сельскохозяйственной продукции, обработанной хлормекватом, например, из Канады. Временной лаг между нормативными изменениями EPA и повышением концентрации хлормеквата, обнаруженными в образцах мочи в 2023 году, может быть объяснен несколькими сценариями, такими как задержки с внедрением сельскохозяйственных методов, использующих хлормекват, задержки в заключении американскими компаниями торговых соглашений и исчерпании запасов старых продуктов и / или задержки в покупке овса частными лицами из-за длительного срока годности продуктов из овса.
Чтобы определить, отражают ли концентрации, наблюдаемые в образцах мочи в США, потенциальное воздействие хлормеквата с пищей, мы измерили содержание хлормеквата в пищевых продуктах на основе овса и пшеницы, приобретенных в США в 2022 и 2023 годах. Овсяные продукты содержали хлормекват чаще, чем пшеничные, и количество хлормеквата в различных овсяных продуктах варьировалось, средний уровень составлял 104 ppb, возможно, из-за поставок из США и Канады, что потенциально отражает различия между продуктами, произведенными с добавлением овса, обработанного хлормекватом, или без него. Для сравнения, в образцах пищевых продуктов из Соединенного Королевства хлормекват гораздо чаще встречается в продуктах на основе пшеницы, таких как хлеб, в 90% образцов, собранных в Великобритании в период с июля по сентябрь 2022 года, были обнаружены уровни хлормеквата со средней концентрацией 60 частей на миллиард. Аналогичным образом, хлормекват был обнаружен в 82% образцов овса в Великобритании за то же время со средней концентрацией 1650 частей на миллион, что более чем в 15 раз выше, чем в образцах в США, что может объяснить более высокие концентрации в моче, наблюдаемые в образцах в Великобритании [20].
Результаты нашего биомониторинга указывают на воздействие хлормеквата до 2018 года, несмотря на отсутствие установленных пищевых допусков для хлормеквата. Хотя мониторинг содержания хлормеквата в пищевых продуктах в США не ведется и нет исторических данных о концентрациях хлормеквата в продуктах, продаваемых в США, мы подозреваем, что это воздействие, скорее всего, было диетическим, учитывая короткий период полураспада хлормеквата. Кроме того, было показано, что естественное образование хлормеквата из предшественников холина в пшеничных продуктах и яичном порошке происходит при высоких температурах, таких как те, которые используются при обработке пищевых продуктов, в результате чего концентрация хлормеквата составляет от 5 до 40 нг / г [21]. Результаты наших пищевых тестов показывают, что уровни хлормеквата в некоторых образцах, включая один органический продукт на основе овса, были аналогичны тем, о которых сообщалось в исследовании естественного образования хлормеквата, в то время как во многих других образцах они были выше. Таким образом, уровни, наблюдаемые в моче до 2023 года, могут быть результатом воздействия хлормеквата с пищей в результате переработки пищевых продуктов. Наблюдаемые уровни в 2023 году могут быть обусловлены сочетанием воздействия хлормеквата с пищей в результате самопроизвольного образования, а также импортных продуктов, обработанных хлормекватом в сельском хозяйстве. Различия в воздействии хлормеквата в наших образцах также могут быть обусловлены географическим положением, различным рационом питания или профессиональным воздействием в результате использования хлормеквата в теплицах и питомниках.
Наше исследование показывает, что для полной оценки потенциальных пищевых источников хлормеквата у лиц с низким уровнем воздействия необходимы больший размер выборки и более разнообразные выборки обработанных пищевых продуктов на наличие хлормеквата. Будущие исследования, включающие анализ исторических образцов мочи и продуктов питания, диетические и профессиональные анкеты и постоянный мониторинг содержания хлормеквата в продуктах питания США как обычных, так и органических, а также образцы для биомониторинга, помогут прояснить факторы, определяющие общее воздействие хлормеквата на население США.
Еще предстоит определить, может ли уровень хлормеквата в образцах мочи и продуктов питания в США повыситься в ближайшие годы. В США хлормекват в настоящее время разрешен только в импортных продуктах из овса и пшеницы, но АООС США рассматривает возможность использования хлормеквата в сельском хозяйстве на неорганических культурах. Возможно, что в случае одобрения такого применения в домашних условиях в сочетании с широким внедрением сельскохозяйственных методов, в которых используется хлормекват за рубежом и внутри страны, уровни хлормеквата, вероятно, продолжат расти в овсе, пшенице и других зерновых продуктах питания, что приведет к более высокому уровню воздействия на население США в целом.
Текущие концентрации хлормеквата в моче, полученные по результатам этого и других исследований, свидетельствуют о том, что отдельные доноры образцов подвергались воздействию хлормеквата на уровнях на несколько порядков ниже референтной дозы (RfD), опубликованной EPA США (0,05 мг / кг массы тела в день), и допустимой суточной нормы потребления (ADI), опубликованной Европейским управлением по безопасности пищевых продуктов (0.04 мг / кг массы тела в день). Однако мы отмечаем, что опубликованные токсикологические исследования хлормеквата предполагают, что переоценка этих пороговых значений безопасности может быть оправдана. Например, у животных, подвергшихся воздействию доз ниже текущих RfD и ADI, составляющих 0,024 и 0,0023 мг/ кг массы тела в день у мышей и свиней соответственно, наблюдалось снижение фертильности [4]. В другом токсикологическом исследовании воздействие во время беременности в дозе, эквивалентной уровню отсутствия наблюдаемых побочных эффектов (NOAEL) в 5 мг / кг, который использовался для определения референтной дозы EPA США, вызвало изменение роста плода, а также метаболизма и состава тела у новорожденных мышей [9]. Кроме того, нормативные пороговые значения не учитывают неблагоприятное воздействие смесей химических веществ, которые могут повлиять на репродуктивную систему, которые, как было показано, вызывают аддитивный или синергический эффект при дозах, меньших, чем при индивидуальном химическом воздействии [22], что вызывает обеспокоенность по поводу потенциальных последствий для здоровья, связанных с текущими уровнями воздействия, особенно для лиц с более высоким пределом воздействия среди населения Европы и США в целом.
Это пилотное исследование нового химического воздействия в США показывает, что хлормекват хлорид присутствует в продуктах питания США, в первую очередь в продуктах на основе овса, и обнаруживается в большинстве образцов мочи, взятых у почти 100 человек в США, что предполагает постоянное воздействие. Кроме того, тенденции в этих данных свидетельствуют о том, что уровни воздействия увеличились и могут продолжать увеличиваться в будущем. Учитывая токсикологические проблемы, связанные с воздействием хлормеквата в исследованиях на животных, и широкое распространение среди населения в европейских странах, а теперь, вероятно, и в США, срочно необходим мониторинг содержания хлормеквата в продуктах питания и людях в сочетании с эпидемиологическими исследованиями и исследованиями на животных, чтобы понять потенциальный вред для здоровья этого сельскохозяйственного химиката при уровнях воздействия, соответствующих окружающей среде, особенно во время беременности.
[/size]