Нацеленный на вакцину qPCR линий раковых клеток, обработанных BNT162b2

Нацеленный на вакцину qPCR линий раковых клеток, обработанных BNT162b2

Предполагаемые события интеграции

[size]
25 ФЕВРАЛЯ 2024 Г. [/size]





Ульрике Кеммерер лечила линии раковых клеток MCF7 и OvCar3 различными вакцинами. После трансфицирования они выполнили пассирование клеток на этих трансфицированных клеточных линиях, чтобы разбавить остаточную вакцину и идентифицировать клетки, которые были трансфицированы. Они провели иммуногистохимию (IHC) на этих клетках и задокументировали уровни экспрессии spike.
Затем они обратились к нам, чтобы узнать, сможем ли мы найти какую-либо ДНК или РНК в клеточных линиях. В этой теме будет задокументировано то, что мы обнаружили на уровне ДНК и РНК.




Протокол окрашивания приведен в (Мерц М. Отчет о клиническом случае: Мультифокальный некротизирующий энцефалит и миокардит после мРНК BNT162b2 Вакцинации против COVID-19. Вакцины (Базель). 1 октября 2022 г.;10(10):1651. doi: 10.3390/vaccines10101651. PMID: 36298516; PMCID: PMC9611676.)





Ниже приведено описание qPCR и выполненного секвенирования.








При оценке событий интеграции генома необходимо учитывать потенциальные редкие побочные реакции, которые возникают при секвенировании Illumina. Illumina использует стадию концевой репарации, которая добавляет A к каждому 3’-концу dsDNA для создания ДНК с аденозиновым выступом. Это известно как реакция "“Плюс А”, обычно проводимая с полимеразой Кленова, которая имеет тенденцию добавлять As к 3 гидроксильным концам тупой дцДНК.

[size]
Этот этап имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы gDNA не лигировала саму себя и не образовывала химерную ДНК во время реакций лигирования. Затем добавляются в избытке праймеры для секвенирования. На этих прайм-листах указан плюс T. Это гарантирует, что лигировать к gDNA может только праймер для секвенирования, а геномная ДНК будет несовместима с самолигированием. Если по какой-либо причине реакция с добавлением A не завершается и часть gDNA не реагирует с добавлением A, химерную gDNA можно лигировать. Эта побочная реакция образования химеры должна быть случайной, поэтому крайне маловероятно, что 2 фрагмента лигируются друг с другом на одном и том же основании в геноме. Вероятность получения 2 фрагментов для образования химерных молекул на одном и том же основании в геноме составляет 1 шанс из 3 миллиардов.
Способ борьбы с этим - потребовать, чтобы по крайней мере 2 разные уникальные молекулы вызывали событие интеграции.
Что такое ‘уникальная’ молекула ДНК?
Каждый фрагмент ДНК имеет определенное стартовое и стоп-основание. Молекулы ДНК, имеющие одинаковое стартовое и стоп-основание, могут встречаться естественным образом на стадии ДНКазы, используемой для расщепления ДНК на мелкие кусочки для секвенирования Illumina. Эти повторяющиеся последовательности часто не учитывают, поскольку они также могут возникать в процессе ПЦР, используемом для амплификации библиотеки Illumina. Они называются дубликатами ПЦР или ‘двойными’. Такие инструменты, как Picard, ищут считывания, которые имеют одну и ту же стартовую и конечную базу, и помечают их как потенциальные дубликаты ПЦР. Секвенсоры Illumina также могут создавать повторяющиеся последовательности с помощью так называемых оптических дубликатов. Это программный артефакт, который вызывает одну колонию в матрице секвенирования как две колонии. В результате данные секвенирования также имеют одинаковую начальную и конечную базу. Их легче идентифицировать, поскольку их координаты на матрице находятся в непосредственной близости.
В данной области разработаны методы для решения этой проблемы с использованием UMIs (Уникальных молекулярных идентификаторов). UMI представляют собой синтетические последовательности штрих-кодов ДНК, которые вы лигируете на концах вашей ДНК перед выполнением любой амплификации. Поскольку к каждой молекуле ДНК добавляется уникальный штрих-код, вы можете определить, имеют ли считыватели, которые используют одну и ту же начальную и конечную базы, один и тот же штрих-код ДНК. Если это происходит, то вы знаете, что ПЦР чрезмерно амплифицировала эту молекулу. Затем вы можете использовать эти UMI для нормализации дифференциальной ПЦР, которая могла произойти при амплификации библиотеки. Некоторые участки могут амплифицироваться в 1000 раз, а другие в 10000 раз, и это будет легко определить, собрав только одинаковое количество последовательностей из каждого штрих-кода UMI. В нашем эксперименте мы не использовали UMIs, поэтому мы должны рассматривать все считывания с одинаковой начальной и конечной точками как неуникальные считывания.
По этим причинам мы не рассматриваем какое-либо единичное прочтение в качестве доказательства события интеграции. Мы хотим видеть по крайней мере 2 уникальные молекулы с разными начальными и стоп-основаниями, охватывающие химерную последовательность вакцины и событие последовательности человека, чтобы рассматривать это как предполагаемое событие интеграции.
Поскольку секвенирование может быть дорогостоящим, мы сначала проверяем, какие клетки стоит секвенировать, путем qPCR-скрининга клеток после обработки вакциной. Только qPCR-позитивные клетки будут переведены в секвенирование.
Сначала мы начинаем с qPCR вакцин, прежде чем они будут применены к клеткам, чтобы понять степень загрязнения ДНК.
qPCR некоторых из этих вакцин с мРНК регистрирует такие низкие показатели CT, как CT 12,72!
Методы qPCR были описаны ранее.



[/size][size]
Проводят разведения 1: 10, поскольку в некоторых флаконах с вакцинами мы заметили, что прямой qPCR самой вакцины ингибирует qPCR.
В таблице 2 приведены разведения qPCR клеточных линий, обработанных различными вакцинами, в соотношении 1:10. OVCAR - это OvCar3. P1 и P2 представляют произошедший пассаж клеток. P1 = 1-й пассаж и P2 = 2-й пассаж. Mod = Moderna Lot (133 против 140A). PB = Pfizer/BioNTech с партиями (9715 и 1042A).
RNAP - это внутренний контроль, который амплифицирует геном человека. Этот набор праймеров уже готов к продаже в IDT, поскольку он используется в qPCR C19.



[/size][size]
Примечание Ожидается, что Moderna не будет амплифицироваться SV40. Важно обратить внимание на NTC. Несколько NTC загораются в диапазоне 37-38. Это говорит вам о том, что вы не должны доверять никаким данным из этих каналов, кроме результатов компьютерной томографии. Известно, что бактериальное происхождение репликации всегда приводит к амплификации NTCs при CT 37+, потому что полимераза, используемая в этих наборах qPCR, экспрессировалась из бактериальной плазмиды, имеющей этот Ori, и небольшие количества этой остаточной ДНК могут быть обнаружены при CT 37. У Moderna обнаружен один положительный результат на SV40 с показателем 36,90, в то время как все NTCS чисты на SV40. Это может быть результатом низкого уровня заражения SV40 в этих клеточных линиях. Обратите внимание, что это происходит на 3-5 СТ позже, чем при обнаружении Pfizer SV40, так что это может быть просто шум.
RT-qPCR партий вакцины представляют собой комбинацию сигналов РНК и ДНК и демонстрируют еще более низкие показатели CT для SV40 (таблица 3). Это был RT-qPCR вакцин непосредственно ПЕРЕД их применением к перечисленным клеточным линиям.



[/size][size]
В таблице 4 приведен RT-qPCR клеток после нанесения вакцины на каждую клеточную линию и пассирования. Обратите внимание, что прохождение 1 происходит на ~ 5 CTs раньше, чем прохождение 2. Мы не ожидаем, что RNAP будет отличаться в разных пассажах. Обратите внимание, что векторный ампликон имеет CT 30,28 для 1-го пассажа для OVCARP1 и 34,72 для 2-го пассажа. ~ 4CTs - разница в 16 раз.
Поскольку между пассажами проводили несколько 100-кратных разведений (промывки 10 мл PBS), если бы это было простое разведение между пассажами, мы ожидали бы снижения показателей CT в 100-10000 раз, что составляет 6-12 CTs. Мы не видим этого, что демонстрирует, что ДНК / РНК находится в клетках и не разбавляется при каждой промывке.
Данные qPCR показывают большую дельта-CT между пассажами (5-6 CTS или 32-64-кратное разведение).



[/size][size]
Повторный запуск в разведении 1:10 в RT-qPCR





Библиотеки ДНК часовщика были сконструированы в соответствии с протоколом производителей для qPCR-позитивных клеточных линий OVCAR пассажа 1 и пассажа 2. Клеточные гранулы лизировали 100 мкл MaGiC Lysis (номер партии Medicinal Genomics P/N 420180) (95С в течение 10 минут и 4С в течение 5 минут). к образцу добавляли 100 мкл стабилизирующего буфера. 50 мкл этого 200 мкл лизата очищали 150 мкл SenSATIVAx. Гранулы отделяли и промывали 2 раза 70% EtOH. Гранулы элюировали в 25 мкл ddH20 и 20 мкл, использованных для создания библиотеки часовщика. Библиотеки секвенирования кодировали штрихкодом ДНК и отправляли слепому поставщику последовательностей Illumina















































[/size][size]

Проверка события интеграции по Сэнгеру в библиотеке Illumina показана выше.








































Дополнительные наблюдения
Репликация плазмидной ДНК в клеточных линиях
Глубина секвенирования вакцины в OvCar3 составляет более 3000 раз, в то время как глубина секвенирования геномов OvCar3 составляет 30 РАЗ. Для сравнения, при секвенировании диплоидных геномов человека (2-кратное покрытие) вы обычно получаете 1000-10000-кратное покрытие митохондриального генома, поскольку в каждой клетке имеется несколько копий. Аналогичная картина наблюдается у растений, имеющих геномы как митохондрий, так и хлоропластов. Эти вакцинные плазмиды имеют 100-кратное покрытие на 1X геном человека. Это выше, чем я ожидал, и намного выше, чем предсказывала любая проверка фактов.
Наблюдается еще одна странная вещь. В плазмидном векторе присутствуют SNP, которые отсутствуют в вакцине, которая никогда не подвергается воздействию каких-либо клеток. Это признак того, что клетки мутируют плазмиды.





Почему SNP в плазмидном источнике репликации присутствуют только тогда, когда плазмида трансфицирована в клетку? Эти SNP отсутствуют в контрольной последовательности вакцины (левая сторона нижней дорожки на рисунке выше). Варианты находятся в фазе и имеют частоту аллелей 12% -40%.




Если снизить частоту аллеля до 10%, в этом бактериальном источнике репликации появляется еще один SNP.





Существует также SNP в происхождении репликации F1 (частота аллеля 12%).





Происхождение F1 происходит от фагемиды, которая инициирует синтез ssDNA. Известно, что они образуют шпильки.



[/size][size]





Варианты находятся в стволовой петле бактериального Ori, выделены желтым цветом.

В последовательности вакцины OvCar3 присутствует пятый SNP на 3’ конце этого выделенного участка в начале SV40 (GAGGC[C/G]). Частота аллеля составляет 40%.








Учитывая, что все 5 из этих вариантов существуют в источниках репликации, это, вероятно, свидетельствует о том, что эти компоненты реплицируются в клеточных линиях OvCar3, и это ошибки репликации. Это подтверждается более высоким, чем в среднем, охватом последовательностей в этих областях последовательности OvCar3 / вакцины. Обратите внимание, что SNP приходятся на пики охвата на приведенных ниже графиках охвата IGV. Репликация вряд ли охватит большие расстояния, поскольку большинство фрагментов имеют небольшую длину, но некоторые из более крупных фрагментов, наблюдаемых при секвенировании вакцины oxford nanopore, могут быть легко амплифицированы до более высоких уровней, оказавшись внутри клетки. Некоторые из этих фрагментов размером 3 кб содержали весь ген Neo/Kan с его промотором SV40 и SV40 Ori.




Обсуждения и ограничения
Это линия раковых клеток, которая удваивается каждые 60 часов. Это не означает, что это происходит в клетках пациента, но это может быть моделью того, с чем может столкнуться больной раком в стадии ремиссии после вакцинации.
У этого исследования есть несколько ограничений.
1) Хотя у нас есть подтверждение последовательности Сэнгера этих химерных событий в сгенерированной библиотеке секвенирования Illumina, мы израсходовали большую часть клеток для создания этой библиотеки секвенирования и не можем подтвердить, что это есть в оставшихся клетках, которые у нас есть. В будущих исследованиях будут культивироваться большие количества клеток, чтобы обеспечить более ретроспективное изучение этих событий в исходной вакцинированной клеточной линии. Это редкие явления, поэтому маловероятно, что они присутствуют во всех клетках, и повторная выборка другой коллекции клеток из той же партии клеток может не фиксировать те же события.
2) Поскольку мы использовали короткие считывания из ILMN, у нас нет подтверждения обоих концов события интеграции. Таким образом, мы не можем судить о размере события интеграции, пока не зафиксируем другой конец события интеграции. Более глубокое секвенирование библиотеки Illumina может выявить это событие, и в будущих исследованиях следует изучить возможность использования более длительных считываний (ONT или PacBio). Эти платформы требуют большего ввода ДНК и могут потребовать масштабированной трансфекции (большего количества клеток).
3) Оба предполагаемых события интеграции (Chr9 и Chr12) поддерживаются многократным чтением в библиотеке. Нельзя доверять одноэлементным событиям, поскольку они могут быть результатом химерного лигирования на этапе лигирования библиотекой Illumina. Вероятность того, что две молекулы в библиотеке имеют одну и ту же точку интеграции в зависимости от случайного образования химер при конструировании библиотеки, составляет 1 к 3 миллиардам. То, что это происходит дважды (Chr9 и Chr12) в вакцинированных клеточных линиях с 2 независимыми считываниями, подтверждающими каждое событие, и нулевым повторением в невакцинированном контроле, означает, что они являются сильными претендентами на интеграцию. Подтверждение секвенированием Сэнгера прохождения ампликонов через событие интеграции с использованием праймеров, отличных от используемых на кластерной станции Illumina, подразумевает, что это не артефакты кластерной ПЦР, скачкообразного изменения индекса или оптических артефактов, которые, как известно, возникают на низких частотах на секвенсорах Illumina.
4) Известно, что линии раковых клеток подвергаются хромотрипсису, который представляет собой разрушение генома. Возможно, эти химерные события представляют собой лигирование внехромосомных фрагментов хромосом. Следовательно, требуются длительные считывания для устранения более эфемерных событий хромотрипсиса в результате долгосрочной хромосомной интеграции.
Подводя итог, эти данные действительно демонстрируют, что SV40, Источник репликации и спайковая ДНК могут быть обнаружены по крайней мере в 2 клеточных пассажах в вакцинированных клеточных линиях OvCar3. Этого не наблюдается в необработанных клеточных линиях. Дополнительно в библиотеках цельного генома образцов, обработанных вакциной, была обнаружена ДНК-спайк при 3000-кратном охвате, в то время как геном человека был только при 30-кратном охвате. Требуется дальнейшая работа для подтверждения размера и частоты этих событий интеграции и исключения артефактов, связанных с Illumina, которые могут привести к ложноположительным событиям интеграции.
Кроме того, обнаружение SNP в вакцинных плазмидах origin of replications (F1 и SV40) является признаком того, что клеточные линии OvCar3 инициируют репликацию ДНК после трансфицирования. Таким образом, небольшое количество ДНК-контаминации, содержащей избыточные элементы репликации млекопитающего происхождения, может привести к увеличению количества ДНК, попавшей внутрь клетки. Это должно учитываться в нормативных актах, касающихся остаточного ДНК-контаминации. Простое ограничение в 10 нг для всей ДНК следует пересмотреть, если загрязняющая ДНК содержит миллиарды копий млекопитающего происхождения репликации. Вакцины Moderna не содержат последовательности SV40 или F1, поэтому очевидно, что эти последовательности представляют ненужный риск в вакцине Pfizer.
Эта работа показала нам, что несколько участков плазмидной ДНК, идентичных митохондриальным последовательностям человека или последовательностям polyA, не могут быть идентифицированы на предмет интеграции, поскольку они существуют как в вакцине, так и в геноме человека.
Требуется дальнейшая работа для подтверждения этих предполагаемых событий интеграции. Более длительные считывания и более глубокое секвенирование в настоящее время оправданы и должны быть приоритетными.
Данные секвенирования FastQ для OVCAR3-PB9715
Эти считывания не обрезаны и идентичны считываниям, предоставленным поставщиком последовательностей.
•https://mega.nz/file/9ZgyjYrQ#zZUf8X5FkW-a2_sGBN4G37TqQkLFITMQf77_-Uq0ZAo
•https://mega.nz/file/VRQwyAiT#LQGQCjNv3YNqCImrH8ENJGdek5qxphGXS6xTZucAMII

Мы обновили это хранилище данных, чтобы оно также содержало урезанные данные. Эти хэши не будут соответствовать данным поставщика последовательностей, поскольку мы урезали значения в соответствии с рекомендациями доктора Хироши Аракавы.
Они содержат секвенирование всего генома обработанных BNT162b2 и необработанных клеток OvCar3.
https://mega.nz/folder/hFwSUaSJ#p1I9OwzBwzBsnXEHpPmfUw
https://mega.nz/folder/RFxxgATI#AU9Yey8IH5OAeMA-YeHx-A

Если ваш браузер запрашивает ключ шифрования, попробуйте другой браузер. Ключ шифрования находится после # в URL-адресе, но некоторые браузеры его не обрабатывают.[/size]